Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 제브라 피쉬 배아에서 사진 전환 세포를 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 배아를 매립하고, 조직 특이적 광, 낮은 용융 온도에서 컨버터블 형광 단백질을 발현함으로써 달성됩니다. 다음으로, 관심 영역 내의 단백질은 완전히 광으로 변환됩니다.

그런 다음 배아를 aros에서 조심스럽게 제거하고 후기 단계까지 섭씨 28.5도의 난수 속에서 유지합니다. 마지막으로, 사진으로 변환된 배아는 다시 낮은 용융 온도의 배아에 삽입됩니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경 검사를 통해 광변환된 단백질의 안정적인 존재로 인해 광변환된 세포가 나중에 정확하게 검출될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

그래서 우리는 오늘 우리가 제시할 방법이 세포 및 발달 생물학의 맥락에서 매우 유용할 것이라고 생각합니다. 따라서 우리는 세포 이동, 조직 역학 및 기타 세포 행동의 맥락에서 이 방법론을 사용하는 것이 매우 유용할 것이라고 생각합니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사후 연구원인 베로니카 롬바르도(Veronica Lombardo)가 형질전환 제브라피시를 교배한 후 광 전환 형광 단백질을 발현

동형접합적인 가장 밝은 배아를 선택하고 원하는 단계에 도달했을 때 섭씨 28.5도에서 성장합니다. 집게를 사용하여 배아를 마취하기 위해 달걀 물이 담긴 유리 용기에 코팅합니다. 유리 피펫 또는 절단된 피펫 팁을 사용하여 한 번에 하나씩 trica로 옮깁니다.

마취된 배아를 배양 접시의 덮개로 옮기고 배아를 가능한 가장 작은 부피의 배지 내에서 유지합니다. 섭씨 30도의 트리카(trica)와 함께 1%의 낮은 용융 온도 아그로스(agros)로 피펫팅하여 배아를 아로스(aros)로 옮기고 덮개 유리 바닥의 배양 접시에 넣습니다. 부드러운 플라스틱 팁을 사용하여 아그로스가 중합되었을 때 배아의 방향을 잡습니다.

405, 488 및 561 나노미터 레이저 소스와 20 x 대물렌즈가 장착된 도립 컨포칼 현미경에서 Trica 솔루션으로 덮으십시오. 488 및 561 나노미터 레이저를 사용하여 관심 영역을 포함하는 표본의 전체 구조에 대한 Z 스택을 생성합니다. 시계열 도구를 선택하고 간격 없이 두 개의 주기(하나는 사전 사진 변환용, 다른 하나는 사후 사진 변환용)로 설정합니다.

영역의 도구를 선택하고 사진 변환을 위해 하나 이상의 관심 영역을 정의합니다. 그런 다음 표백 도구를 선택하고 스캔 후 표백 시작을 설정합니다. 여기에 사용된 두 가지 중 하나는 30밀리와트 405나노미터 다이오드 레이저입니다.

완전한 사진 변환에 필요한 최소한의 레이저 광에 맞게 신중하게 최적화되었으며, 이는 레이저 광의 강도, 관심 영역의 스캔 반복 및 스캔 속도를 변경하여 달성됩니다. 488 나노미터 및 561 나노미터 레이저로 샘플을 스캔하여 광 변환 형광 단백질의 남아 있는 녹색 및 광으로 변환된 적색 형광을 시각화합니다. 사진 변환 후 용액을 버리고 바늘이나 부드러운 플라스틱 팁을 사용하여 아그로에서 배아를 조심스럽게 제거합니다.

원하는 발달 단계가 될 때까지 섭씨 28.5도의 어둠 속에서 배아를 난자에 담근 상태로 유지합니다. 배아를 두 번째로 삽입한 다음 488 및 561 나노미터 레이저를 사용하여 관심 영역을 포함하여 표본의 Zack을 생성합니다. 이 프로토콜은 정상적인 발달에 영향을 미치지 않기 때문에 이후 단계에서 광으로 변환된 배아를 관찰할 수 있습니다.

다음은 사진 변환 분석의 예입니다. 수정 후 48시간에서 72시간까지 제브라피시 발달 과정에서 내피 세포를 추적하여 사진 변환 전에 내피 핵 내에서 킥 G를 발현하는 형질전환 리포터 라인을 사용하여 킥 G가 내피 조직 내에서 발현되었으며 적색 형광을 위한 561 나노미터 레이저로 488 나노미터 아르곤 레이저 제어 스캔을 사용하여 녹색 형광으로만 검출할 수 있었습니다. 사진 변환 전에 사진 변환 킥 GR을 감지하지 못했습니다.

그 후, 관심 영역은 405 나노미터 다이오드 레이저를 사용하여 10% 강도, 20회 반복으로 완전히 사진 변환하고 488 나노미터 및 561 나노미터 레이저를 사용하여 헤드 혈관을 다시 스캔했습니다. 이 패널에서 녹색 킥 G는 이후 단계에서 광으로 변환된 내피 세포를 추적하기 위해 관심 영역 내에서 빨간색으로 완전히 전환되었습니다. 배아는 사진 변환 후 24시간에 관찰되었으며, 이는 사진 변환된 관심 영역에서 발생하는 내피 조직 내에서 수정 후 약 72시간이다.

적색 형광 광으로 변환된 킥 G의 안정성과 개발 후 새로운 녹색 비변환된 킥 G의 합성으로 인해 비(非)변환킥 G 단백질과 광변환킥 G 단백질이 모두 관찰되었다. 이 기술은 발생 생물학 분야의 연구자들이 여러 물고기의 세포 생물학 및 조직 리모델링을 탐구하는 데 앞장섰습니다.