Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время Arabidopsis семядолей Эпидермиса во время прорастания

Целью данного эксперимента является визуализация ранних событий развития эпидермиса после прорастания семян на клеточном уровне. Это достигается путем предварительного удаления семенной оболочки, чтобы обеспечить четкий обзор косина в качестве второго шага. Козоны крепятся под слоем агаровой среды, которая иммобилизует их и поддерживает их развитие. Последующая покадровая визуализация проводится в течение нескольких дней, чтобы наблюдать за ростом и делением эпидермальных клеток in vivo.

Были получены результаты, которые показывают динамическую экспрессию генов и локализацию белка на основе видимой флуоресценции. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как неподвижные изображения окрашивания Гаса или слияния GFP, заключается в том, что она показывает динамическое движение белков во время деления и дифференцировки клеток. Семена Arabidopsis для этого эксперимента стерилизуют в растворе для стерилизации семян, изготовленном из 33% бытового отбеливателя, и 0,1% Triton X 100 помещают семена, несущие нужные флуоресцентные репортерные конструкции и генотипы, в пробирку объемом 1,7 миллилитра и наносят один миллилитр стерилизационного раствора, инкубируют на мутаторе в течение 15 минут.

В стерильном колпаке с помощью пипетки удалите стерилизационный раствор из пробирки, оставив семена. Смойте одним миллилитром стерильной воды. Повторите четыре раза после четвертого полоскания.

Инкубировать при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух или более дней. Для приготовления камерного стекла смешайте 20 миллилитров 0,5%-ного раствора бакта с агаром в воде в колбе объемом 200 миллилитров и разогрейте в микроволновой печи до полного растворения. Будьте осторожны при кипячении раствора.

Назовем раствор примерно 60 градусами по Цельсию. Слишком горячий раствор или слишком быстрое нанесение может расплавить клей или треснуть стекло предметного стекла. Когда агаровый раствор достаточно остынет, соберите один миллилитр с помощью пипетки и медленно нанесите его на покровное стекло внутри камеры сразу же предметного стекла.

Добавьте второй миллилитр раствора агара. Теперь агар Медиа должен полностью покрыть нижнюю часть затвора патронника. Этого минимального количества среды достаточно для поддержания развития в растении олеина, который содержит питательные вещества, накопленные в течение четырех-пяти дней, поддерживая влажность и обеспечивая диффузию газов.

Вызывайте горку с накрытой камерой на столешнице. Чтобы начать эту процедуру, извлеките пробирку со стерильными семенами из четырех градусов Цельсия хранения. Положите бумажные салфетки на предметное столико для препарирования микроскопа, смочите их водой и отрегулируйте так, чтобы получилась гладкая поверхность.

Ткань используется для стабилизации семян во время рассечения. Пипеткой нанесите от 20 до 30 семян из пробирки на ткань, стараясь аккуратно разместить их в поле зрения препарирующего прицела. Препарирование со-свинца является самым сложным аспектом этой процедуры.

Использование малого увеличения и острых щипцов и очень осторожность помогут обеспечить успешное рассечение с использованием острых щипцов. Аккуратно удалите оболочку семян с рассады изнутри, необходимо удалить как внешние, так и внутренние покровы. Затем с помощью скальпеля отрежьте свинец в кроватке, освободив его от гиперкотта и радикалов.

Полезно удалить гиперкроватку и радикал для визуализации, потому что если она не повреждена, гиперкроватка выпрямится и значительно удлинится. Переместив Косс Лидин из поля зрения покадровой съемки, держите расчлененный кос свинец погруженным в воду. Повторяйте вскрытие семян до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество олеана.

Рекомендуется провести от 15 до 20 успешных вскрытий перед установкой олеана в предметное стекло камеры. Чтобы подготовить предметное стекло камеры к монтажу котана, используйте небольшой защитный листок, чтобы разрезать агаровый материал и поднять весь слой вверх от стеклянного основания камеры. С помощью дозатора препарированный котан с минимальным количеством воды из удерживающей трубки поступает в камеру.

Скользните под поднятым слоем агара. Аккуратно опустите агар на седины. Если присутствует лишняя вода, смочите ее салфеткой.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить седины после завершения монтажа. Экземпляры больше не должны легко двигаться. Поместите крышку на предметное стекло камеры и перенесите предметное стекло на предметный столик микроскопа.

Перед получением изображения настройте инвертированный конфокальный микроскоп для получения изображения нужного флюоритора. Параметры LSM 700 предназначены для возбуждения GFP на 488 нанометров и сбора. С полосовым фильтром на 440 - 530 нм и для возбуждения RFP на 555 нм и сбором.

С полосовым фильтром от 570 до 610 нанометров с 20-кратным объективом. Сосредоточьтесь на вводе ACO и переместите объектив в центр камеры. Скольжение в режиме съемки изменяет масштаб на 0,5 и размер кадра на 48 на 48 пикселей.

Установите флажок «Положение» и отсканируйте обзорное изображение, а затем увеличьте количество горизонтальных и вертикальных плиток до 30–35. Нажмите кнопку сканирования, чтобы начать сканирование. Когда сканирование будет завершено, нажмите кнопку «Положение» на вкладке «Размеры» и установите перекрестие на каждой койке, ведущей для наблюдения.

Осмотрите установленные экземпляры на наличие повреждений. Удалите позиции, соответствующие поврежденному свинцу, чтобы оставить только подходящие образцы для визуализации. Затем настройте серию Z, охватывающую свинцовый эпидермис всех образцов.

Установите флажок Zack. Выберите каждую позицию в списке позиций и нажмите кнопку «Переместить в». Сосредоточьтесь на самой верхней плоскости отведения в эпидермисе и нажмите кнопку «Установить первый» под Заком.

Сосредоточьтесь на самом низком положении, при котором эпидермис будет хорошо виден. И нажмите кнопку «Установить последнюю». Нажмите кнопку рядом с пунктом «Оптимальный», который показывает оптимальную толщину среза Z для установки.

Проверьте каждую вводную версию kos, чтобы убедиться, что эти настройки охватывают все образцы. Параметры Z не могут быть установлены для отдельных позиций. В используемом здесь программном обеспечении Zen 2009 настроены временные ряды с желаемым разрешением и длиной интервалы от 15 до 30 минут в течение трех дней, которые эффективны для динамики белка в делении эпидермальных клеток, но интервалы могут быть изменены по мере необходимости.

Установите флажок временного ряда в разделе Циклы временных рядов для желаемого количества изображений, введя в текстовое поле Установите интервал равным 30, и используйте раскрывающееся меню, чтобы выбрать MIN для начала XY, многопозиционное сканирование ZT, измените размер кадра до желаемого разрешения и начните эксперимент по сбору. Обратите внимание, что количество позиций должно быть ограничено спецификациями сканирования. Если общее время сканирования больше желаемого интервала, временные точки будут неправильными.

С помощью этой системы возможно не более шести одновременных положений при визуализации GFP и RFP на 59 Z-срезах в 30-минутном интервале. Пример набора информативных временных точек, собранных с помощью этого метода, показан здесь. Клеточные мембраны помечены RFP, и GFP объединяет полярный белок под его нативным промотором.

Изображения в серии А показывают, что полярная GFP сначала кажется равномерно распределенной, а затем примерно за два часа до асимметричных делений, обозначенных стрелками. Полярная GFP отделяется от места зарождающегося мейстера OID в серии B после начального асимметричного деления, обозначенного стрелкой, через 47 часов. Полярная GFP исчезает в обеих ячейках.

Подразумевая быстрый переход в состояние материнской клетки с помощью мерисоида, материнская клетка-защитница, обозначенная звездочкой, делится симметрично и дифференцируется с образованием устьичных защитных клеток, в то время как цистоклетка восстанавливает полярную экспрессию GFP, предположительно предшествующую последующему асимметричному делению. Здесь показано обтекаемое зарегистрированное видео локализации полярного GFP во время амплификации и расстановки одной устьичной клетки-предшественника. Первоначально полярные GFP равномерно проявляются в клетке к 39 часам после прорастания.

Он сильно поляризуется непосредственно перед делением в 40 часов, помещая меньшую горничную на противоположном конце клетки. Более крупная клетка справа также восстанавливает идентичность устьичной линии, и через 45 часов локализация Polar GFP перемещается рядом с устьичным предшественником. Деление через 47 часов производит новый стероид справа, ориентированный в сторону от существующего me stamoid, слева от первого me stamoid.

В конечном итоге две стомы разделяются одной клеткой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать долгосрочный таймлапс прорастающего свинца для оценки экспрессии генов и локализации белка в эпидермисе во время развития.