Name: HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda el pasaje de líneas celulares HuES con tripsina para mantener cultivos sanos y genéticamente estables. Este protocolo estandarizado minimiza anomalías cariotípicas en células madre embrionarias humanas.

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General Se recomienda descongelar no más de una muestra en un momento dado para facilitar la manipulación. El operario debe tener cuidado de no dejar a temperatura ambiente, las culturas y las bajas emisiones de CO2 durante largos períodos de tiempo. Todos los centrifugación de las células vivas se realiza a 500-600 g durante 5 min a temperatura ambiente. MEFs (células embrionarias de ratón alimentador) <ol><li> Pre-caliente el MEF los medios de comunicación a 37 ° C. Retire el vial MEF de -80 ° C e inmediatamente se sumerge la parte inferior del tubo en un baño de agua 37 ° C. Se debe tener unos 30-45 segundos antes de que las células son del 80% descongelado (pequeña porción de helado a la izquierda). </li><li> Llevar rápidamente el tubo a la campana de flujo laminar, rocíe con el 70% de alcohol, y la transferencia de células pre-calentado a los medios de comunicación. </li><li> Aspirar la solución de gelatina a partir de placas preparado con anterioridad. </li><li> Alícuota de 2 ml de solución de MEF en una caída de manera inteligente en cada uno de los seis pozos. Asegúrese de distribuir el MEFs uniformemente sobre el bien. Fecha de la placa de MEF, y colocar en una incubadora a 37 ° C durante la noche para permitir que MEFs para conectar a la placa. </li><li> Después de 6 horas MEFs se une a la placa. Lo mejor es utilizar placas MEF 24-48 horas después de la siembra. NO use una placa de MEF que tiene más de 4 días. </li><li> Pre-cálidos tonos medios y el 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C Bajo el capó, prelabel un tubo estéril de 50 ml cónicos. </li><li> Con cuidado aspirar los medios de comunicación tonalidades de la cultura que se divide. Lave suavemente los pocillos con 2 ml de solución tampón fosfato 1X (PBS) por pocillo. Aspirar el PBS. Añadir 0,75 ml 0,05% de tripsina / EDTA al pozo. </li><li> Vuelva a colocar la tapa, y observar las células bajo un aumento de 4x. El MEFs alrededor de las colonias HUES debería comenzar a retraerse. Cuando el MEFs son lo suficientemente redondeadas y las fronteras de las colonias Las tonalidades son ásperas, devolver la placa a la capilla. Este proceso debe tomar alrededor de 5 minutos, absolutamente no más de 10 minutos, o sus células no volverá a crecer. </li><li> Pipeta suavemente hacia arriba y abajo, lavando el fondo del pozo, hasta que el MEF ha monocapa completamente separado (monocapa es pegajosa y puede permanecer en una sola pieza). </li><li> La transferencia de la suspensión de células a un tubo cónico de 50 ml que contienen los medios de comunicación HUES adicionales. Girar el tubo de células 500xg durante 5 minutos, se aspira de los medios de comunicación, tenga cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> A la placa en un nuevo plato de MEFs, agregar el volumen adecuadamente determinado de células de los medios de comunicación HUES adicionales, y la pipeta la solución 5-7 veces con una pipeta automática. </li><li> Retire el papel MEF a partir de una placa fresca de MEFs. </li><li> Alícuota de la caída de HUES solución inteligente a cada pocillo, asegurándose de que la distribución de las gotas uniformemente sobre el bien. Sin mover la placa, con cuidado retorno a las células a una incubadora a 37 ° C durante la noche para dejar la semilla HUES colonias. </li><li> Células HUES saliendo de una división debe comportarse de manera similar a los que salen de un deshielo. </li></ol>

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</ol>

En este vídeo se demuestra la forma en que habitualmente HUES paso humano líneas de células madre embrionarias en nuestro laboratorio. División eficaz y regular y pases es esencial para mantener un saludable humano línea de células madre embrionarias. Paso de la tripsina mediada es una ventaja significativa de las líneas de células HUES, sin embargo, es importante no trypsinize sobre las culturas o de tener una gran proporción de células individuales durante la re-lotificación.

HUES medios 651,5 ml KO-500 ml DMEM Penstrep 6,5 ml 6,5 ml GlutaMAXTM AANE 6,5 ml de 2-mercaptoetanol 0.5ul KO reemplazo suero 65 ml 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / ml final) 0,65 ml

hues pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina. Células madre embrionarias humanas son artefactos de cultivo celular, y tienden a adquirir las anomalías del cariotipo con duplicaciones de población. Pases adecuada es esencial para el mantenimiento de una sana, las tonalidades diferenciadas, cariotipo normal de madre humanas embrionarias cultivo de células. En primer lugar, una cultura en expansión se lava con PBS para eliminar los medios de comunicación residuales y los desechos celulares, y luego las células se cubren con un volumen mínimo de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA. Tripsina se deja en las células durante un máximo de cinco minutos, luego las células se desprendió suavemente con una pipeta serológica 2 ml. La suspensión celular se recoge y se mezcla con una gran cantidad de medios tonos, y luego las células se recogieron por centrifugación suave. La mezcla de los medios de comunicación inactiva la tripsina se elimina, y las células se resuspendieron en pre-calentado los medios tonos. Una relación de separación adecuada se calcula (en general, 1:10-01:20), y las células re-chapada en una placa de 1-2 días de edad que contiene una monocapa de células embrionarias de ratones irradiados fibroblastos de alimentación. La placa recién sembrado HUES la cultura se deja en reposo durante 48 horas, entonces el medio se cambia todos los días a partir de entonces. Es importante no trpsinize hasta una suspensión de células individuales, ya que esto aumenta el riesgo de introducir alteraciones del cariotipo.

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

En este video, demostramos cómo nuestro laboratorio realiza habitualmente el pasaje de líneas de células madre embrionarias humanas HuES mediante el uso de tripsina. Las células madre embrionarias humanas son artefactos...

Esto es, ¿dónde ejecutaste las técnicas? Oh, ¿dónde te enseñé? La primera vez que te enseñé Bel, pasé el verano en mi T.Yeah.Y eso fue como, nos gustaron las cosas de cartílago allí. Y entonces me gustaba la cultura social allí. Y luego, en Hopkins, en mi último año, trabajé con diferentes, así que, por ejemplo, en el tema de la ingeniería, se trataba mucho más de intentar, diseñamos tridimensionalmente eso.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

El cariotipo es una técnica sencilla y útil ampliamente utilizado para la detección de alteraciones genéticas. A continuación se describe paso a paso el protocolo para la preparación de los cromosomas propagación de células madre embrionarias humanas para controlar el estado cromosómico de estas células se mantienen en cultivo.

Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Diferenciación dirigida de células embrionarias humanas en específico ha generado mucho interés en la medicina regenerativa. Ofrecemos una concisa, paso a paso el protocolo para determinar...

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Este protocolo proporciona una forma sencilla y eficiente de propagar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de hPSC.

Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

La generación de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes in vitro permite el acceso a grandes cantidades de tejido cardíaco in vitro para aplicaciones clínicas y de ciencia básica.  Este protocolo utiliza el factor atrializante Grem2 tanto para aumentar el número de cardiomiocitos obtenidos como para generar cardiomiocitos con un fenotipo auricular.

La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

Este método se puede utilizar para examinar el acortamiento del sarcómero usando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.

Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Aprenda el pasaje de líneas celulares HuES con tripsina para mantener cultivos sanos y genéticamente estables. Este protocolo estandarizado minimiza anomalías cariotípicas en células madre embrionarias humanas.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

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