Name: Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende a preparar rebanadas de retina de salamandra tigre acuática para registrar simultáneamente fotorreceptores y neuronas de segundo orden mediante técnicas de electrofisiología.

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Este trabajo fue financiado por la investigación para prevenir la ceguera y los Institutos Nacionales de Salud de subvención EY10542.

1. Rebanadas de retina Preparación <ol><li> Monte la cámara (diseño ilustrado en la Figura 1). Se colocan dos gotas de grasa de vacío, espaciados ~ 8-10 mm aparte, a través de la cámara de grabación para formar un canal para superfusate y en el que se incorporará las rodajas de la retina. Añadir una segunda gota de grasa de unos pocos milímetros más lejos hacia fuera más allá de cada uno de estos dos gotas de grasa para actuar como un dique y el límite de desbordamiento. Colocar una pequeña pieza triangular de KIMWIPE en el extremo de la cámara para asegurar el contacto de fluido con el electrodo de referencia. </li><li> Pulse una pieza de membrana de nitrocelulosa (~ 5 x 10 mm; 0,8 poros micras) plana contra el portaobjetos de vidrio en dos pequeñas gotas de grasa de vacío. Evitar poner grasa directamente debajo del centro de la membrana de nitrocelulosa, ya que esto puede evitar que se adhiera la retina. </li><li> Para preparar la máquina de cortar el tejido, romper una hoja de afeitar de doble filo en 4 trozos y coloque uno en el brazo de corte. Corte una rebanada delgada de nitrocellulmembrana ose para asegurar que el borde de corte de la cuchilla de afeitar quede plana contra la cámara de registro y por lo tanto corta limpiamente a través de la membrana de nitrocelulosa. </li><li> Mantenga un pequeño vaso de precipitados de solución salina anfibio (Tabla 1) en el hielo en la estación de disección. </li><li> La eutanasia salamandra por decapitación. Hemisect sagital de la cabeza y la médula a través de la médula espinal. Coloque la mitad de la cabeza en un trozo de algodón humedecido con solución salina anfibio sobre un bloque de linóleo. La otra mitad de la cabeza puede ser envuelto con una toalla de papel húmeda y se almacenó a 4 ° C para su uso posterior en el día. </li><li> Enucleación del ojo. Usando Vannas pequeñas tijeras, cortar la piel que conecta el ojo con la órbita alrededor. Después de la liberación de la parte frontal del ojo a partir del tejido circundante orbital, tire el ojo hacia afuera y deslice las tijeras bajo el ojo para cortar a través de los músculos del ojo y del nervio óptico, liberando el ojo de la órbita. </li><li> Coloque el ojo enucleado en una cama de algodón en elbloque de linóleo. Deseche la mitad de la cabeza. Quite la grasa orbital superior de la parte posterior del ojo. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el centro de la córnea con una cuchilla quirúrgica agudo. Retire la córnea por deslizamiento Vannas tijeras finas en la incisión y se extiende el corte radialmente hacia fuera hacia la ora serrata. Cortar circunferencialmente alrededor de la ora serrata mediante la rotación del bloque de linóleo o el algodón entre los cortes. </li><li> Después de cortar todo el camino alrededor de los ojos, eliminar la córnea y la lente tirando de ellos fuera del lado de la ojera. Mueva el ocular resultante sobre una superficie dura del bloque de linóleo humedecido con solución salina anfibio. Cortar en tres partes con una hoja de afeitar afilada, con un movimiento de sierra fina para asegurar que haya cortado todo el camino a través de la esclerótica. </li><li> Coloque una o dos piezas de ocular en la membrana de nitrocelulosa con la superficie de la retina hacia abajo. Sumerja las piezas restantes con solución salina adicional y colocarlos en el refrigerador a 4 ° C. ~ </li><li> Gently presione la pieza de ocular contra la membrana de nitrocelulosa con unas pinzas finas. Sumergir la membrana de nitrocelulosa y la pieza ocular con varias gotas de solución salina fría y anfibios blot en los bordes con KIMWIPE para ayudar a la retina a que se adhieran. Una vez más, sumergir la copa ocular y la membrana de nitrocelulosa con varias gotas de solución salina anfibio frío y se desprenden de la esclerótica / coroides / epitelio pigmentario de la retina para aislar la retina (que puede aparecer de color rosa debido a la presencia de la rodopsina sin blanquear). Si es necesario, cortar el nervio óptico para liberar la retina. </li><li> Si la retina no está conforme con fuerza, drenar la solución salina con una KIMWIPE para tirar de la retina más firmemente hacia abajo sobre la membrana de nitrocelulosa. Reemplace la solución salina. Repetir, si es necesario. </li><li> Llenar la cámara con solución salina anfibio frío y la transferencia a la etapa de la máquina de cortar tejido. Cortar la retina y la membrana de nitrocelulosa en tiras finas, de trabajo de un extremo al otro girando el micrómetro a vernieren incrementos de 125 m. Presione la hoja de afeitar suavemente pero con firmeza a través de la retina y la membrana de nitrocelulosa. </li><li> Transfiera las rebanadas de retina moviendo tiras de membrana de nitrocelulosa para el canal principal de la cámara de grabación. Levante una tira de membrana de forma gratuita y luego mantenerlo en su lugar mientras se mueve la cámara por debajo de él, asegurándose de mantener los cortes sumergidos. Insertar los bordes de la membrana de nitrocelulosa en las tiras de grasa de vacío, girarlos 90 grados para acceder a las capas de la retina. </li><li> Pulse la membrana de nitrocelulosa plana contra la superficie del vidrio. Incluso si no hay retina en cada pieza, colocar tiras de membrana de nitrocelulosa a intervalos regulares (~ 1 mm de diferencia) a lo largo de toda la longitud del canal de perfusión para ayudar a romper la tensión superficial y mejorar el flujo de fluido. </li></ol> 2. Pares de células enteras grabaciones <ol><li> Después de todas las rebanadas se han transferido, mover la cámara de registro a la etapa de una posición vertical, fijomicroscopio de fase y conecte el cable del electrodo de referencia. Se centran en las rebanadas con una distancia larga de trabajo, inmersión en agua, 40-60X objetivo. El microscopio debe ser colocado sobre una mesa de aire para amortiguar las vibraciones y encerrado en una jaula de Faraday para reducir la interferencia eléctrica. </li><li> Superfuse las rebanadas continuamente a una velocidad de 1 ml / min con solución salina anfibio burbujeado con 100% de O 2. Conectar la aspiración, asegurándose de que la entrada y salida están equilibrados. Caudal de salida se puede regular girando el extremo biselado de la aguja de aspiración o moviendo el KIMWIPE en el extremo de la cámara más cerca o más lejos de la aguja de flujo de salida. La preparación puede conservarse a temperatura ambiente o se enfría con un dispositivo Peltier o, simplemente definiendo un paquete de hielo en la platina del microscopio. </li><li> Examine las rebanadas con poca luz o infrarrojos e identificar un par de células - un fotorreceptor (varilla o cono) y células horizontales o bipolar cerca - a la meta para la grabación de células enteras. Rods pueden ser identified por sus cuerpos celulares grandes y varilla-como los segmentos externos de prominentes (Figura 2A). Los conos son más pequeñas que las barras y tienen pequeños segmentos exteriores cónicas. Célula bipolar y somas celulares horizontales están en la fila más exterior de los cuerpos celulares en la capa nuclear interna (INL; Figuras 2B y 2C). </li><li> Antes de preparar las rebanadas, utilizar un extractor de pipeta para la fabricación de pipetas de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,2 mm, 0,95 mm de diámetro interior con un filamento de vidrio). La punta de cada micropipeta debe ser ~ 1-2 micras de diámetro. </li><li> Usando una aguja de relleno no metálico (por ejemplo, uno fabricado a partir de una jeringa de 1 cc o un Microfil), llenar pipetas con la solución intracelular (Tabla 1) y se unen a el soporte del electrodo. </li><li> Eleve el objetivo del microscopio ligeramente. Coloque la pipeta fotorreceptor debajo del objetivo y luego bajar de modo que la punta se coloca justo por encima de las rebanadas. Repita con tlo segundo pipeta. </li><li> Ajuste cualquier desplazamiento en el actual nivel de referencia en el amplificador. Comprobar la resistencia de pipeta con un 5-10 mV pulso despolarizante. Por lo general utilizan pipetas que van desde 10 hasta 15 mW, el resultado de la larga conicidad de la baja osmolaridad de las soluciones de eje de pipeta y anfibios. Con las soluciones de osmolaridad mamíferos superiores, estas mismas pipetas presentan valores de resistencia de ~ 8-12 mW. Si bien hemos utilizado diámetros de punta más grandes con valores de resistencia de 3-4 mW en soluciones de anfibios, las ventajas proporcionadas por una resistencia inferior de acceso se compensan con una mayor dificultad en el sellado en las membranas celulares y una más rápida resumen de las corrientes de calcio y otros segundos mensajeros sensibles a las respuestas. </li><li> Mientras aplica presión leve, posición positiva la pipeta post-sináptica de manera que hace contacto con el cuerpo celular horizontal o bipolar. A continuación, coloque la pipeta presináptica de manera que entra en contacto con el cuerpo de la célula de un fotorreceptor varilla o cono. Grabaciones appear a ser más estable cuando las puntas de pipeta en contacto con el segmento interno en lugar de el soma, especialmente en los conos. </li><li> Mientras que el control de la resistencia, liberar la presión positiva en la pipeta post-sináptica. A veces, la liberación de la presión positiva es suficiente para formar un sello gigaohmio. Si no es así, aplicar succión suave con una jeringa de 1 ml o por vía oral. Después de la resistencia punta ha crecido hasta&gt; 100 M, aplicar un potencial de mantenimiento de -60 mV. Después de obtener un sello gigaohmio, nulo a cualquier transitorio capacitancia pipeta y repita el procedimiento de sellado para el fotorreceptor pipeta, la aplicación de un potencial de mantenimiento de -70 mV. </li><li> La rotura del parche con la boca o una jeringa para aplicar succión a cada célula a su vez. Rods, conos y células bipolares se suelen romper con una suave succión. Obtención de configuración de célula con una célula horizontal puede requerir una mayor succión (es decir, con una jeringa de 3 cc) en combinación con fuertes pulsos de voltaje rápidos entregados con el f &quot;zap&quot;eature del amplificador de patch clamp. La rotura de la membrana y el establecimiento de la configuración de célula completa será evidente por la aparición de los transitorios de capacitancia de células enteras. </li><li> Confirmar la identidad de la célula post-sináptica fisiológicamente mediante la aplicación de un destello de luz y la entrega de una serie de pasos de voltaje de -120 a 40 mV en incrementos de 20 mV (Figuras 3 y 4). </li><li> Para evaluar si el par de células están conectadas sinápticamente, entregar un breve (25-100 ms), 60 mV paso despolarización del fotorreceptor (a -10 mV, cerca del pico de la corriente de calcio tipo L dependientes de voltaje) y mirar para las corrientes post-sinápticas en la segunda neurona orden (Figura 5). Un fuerte paso despolarizante debe evocar una, transitorios de corriente hacia el interior de post-sináptica rápida en la celda horizontal o APAGADO post-sináptica bipolar causado por una explosión de liberación de vesículas desde el cono (Figura 5). </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La preparación rebanada retina ha demostrado ser muy útil para el análisis de los circuitos y mecanismos empleados por la retina para procesar la información visual. La capacidad de obtener grabaciones de células enteras simultáneamente de las neuronas pre y post-sináptica ha sido particularmente útil en esta tarea. Grabaciones de células enteras apareadas son mucho más fácil de lograr con las rebanadas que con-montaje plana preparaciones de retina debido a que las diferentes capas de la retina están expuestas. Por otra parte, debido a sus grandes neuronas de la retina, salamandras tienen una larga historia como una preparación de retina, por lo que proporcionan un sistema modelo particularmente bien caracterizados. Con la práctica, rodajas saludables de salamandra retina se pueden preparar con regularidad. A pocos pasos clave pueden hacer la diferencia entre el éxito y el fracaso. 1) Asegúrese de que la cuchilla se monta en la máquina de cortar el tejido para que quede plana contra la superficie del vidrio y rebanadas limpiamente aunque tanto el tejido y underlyimembrana de nitrocelulosa ng. Si has hecho un corte limpio a través de la membrana de nitrocelulosa, usted debe oír un ligero clic cuando la cuchilla golpea la superficie de la lámina de vidrio. 2) Asegúrese de que la retina se ha adherido a la membrana de nitrocelulosa. De lo contrario, la retina puede flotar fuera de la membrana durante cualquier etapa de los procedimientos. 3) No exponga las rebanadas cortadas al aire, ya que esto puede dañar muchas de las células superficiales. 4) Asegúrese de que las rebanadas y la membrana de nitrocelulosa se acueste contra el portaobjetos de vidrio para que las capas de la retina se observan bajo el microscopio de disección. 5) Equilibrar las tasas de flujo de entrada y flujo de salida superfusate con el fin de evitar que desborda la cámara de grabación. Esto evita que los cambios repentinos en los niveles de solución, que puede causar movimientos bruscos del tejido. 6) Seleccionar un par saludable de las células cercanas el uno al otro. Las células con citoplasma suave son más saludables que las células con citoplasma granular. Las células más profundas en el corte son más propensos a retener con sináptica intactacontactos. 7) Asegúrese de que la punta de la pipeta no se ha roto o rozado otro tejido o escombros en el camino a las células. 8) Compruebe la resistencia pipeta para asegurarse de que no está obstruido con suciedad o una burbuja, los cuales pueden hacer que sea difícil obtener una grabación de células enteras de calidad. En lugar de fijación de la retina a papel de filtro de nitrocelulosa, algunos investigadores incrustar retinas en un bloque de agar y utilizan un vibratomo para cortar rodajas de la retina. Aunque no hemos probado este enfoque, Kim et al. 11 de discutir las ventajas de ambos enfoques. En su experiencia, el enfoque basado en agar proporciona un rendimiento más consistente de las rebanadas planas con capas retinianas bien delineados pero el enfoque del filtro basado en papel produce fotorreceptores sanos. Los conos y bastones son responsables de la transducción de la luz en los cambios en el potencial de membrana. Con grabaciones emparejados, el potencial de membrana de varillas o conos puede ser MANIPULATED directamente y por lo tanto la capacidad de generar respuestas de la luz, si bien es útil para la identificación de tipos de células, puede no ser esencial. Por lo tanto, a menudo preparamos rodajas de luz blanca. Sin embargo, incluso si se prepara bajo una iluminación brillante, neuronas de la retina salamandra pueden generar grandes respuestas de la luz como se ilustra por las respuestas en la figura. 3. Esto es en parte debido a la relativamente gran reserva de cromóforo en el gran volumen segmento externo, pero también puede reflejar la capacidad de las células de Müller para regenerar 11-cis-retinal a los conos de 12. Para obtener respuestas de la luz totalmente adaptados a la oscuridad, se pueden preparar los rebanadas bajo iluminación infrarroja. Para las disecciones bajo luz infrarroja, concedemos GenIII intensificadores de imagen (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) para los oculares del microscopio de disección e iluminar el tejido con una linterna LED infrarrojo. Para cortar y otros procedimientos que se lleven a cabo bajo el microscopio de disección, se emplea una ima montado en la cabezaintensificador ge. Para la colocación de las pipetas de parche, visualizamos rebanadas utilizando una cámara CCD sensible a infrarrojos (por ejemplo, Watec 502H, Watec Inc., Middletown, Nueva York) montado en la posición vertical, microscopio-fase fija. Con estas precauciones, se pueden obtener respuestas barras expositoras sensibilidad única de fotones 6, 13. Una de las limitaciones de trabajar en rebanadas de retina es que los procesos celulares largo de grandes neuronas retinianas de campo pueden perder muchos de sus dendritas durante el proceso de corte. Rebanada preparativos retina son por lo tanto más útil para el estudio de la fisiología de las células en las que los contactos sinápticos implican procesos cerca del cuerpo celular. Retinas de anfibios y mamíferos comparten muchos de los mismos tipos de células, y utilizan mecanismos fisiológicos similares 14-16. Mientras salamandra retina es un buen modelo para muchos aspectos de la retina de mamíferos, una diferencia importante parece ser la presencia de una vía de varilla dedicado en mamíferos que invoIves contactos de células especializadas barra bipolares en las células amacrinas AII 14. Una limitación adicional de la retina salamandra es el pequeño número de herramientas genéticas desarrolladas específicamente para esta especie. Sin embargo, los anticuerpos y reactivos shRNA que se dirigen a regiones bien conservadas en otras especies pueden ser utilizados con éxito en la salamandra, al igual que muchos inhibidores de moléculas pequeñas y reactivos peptídicos. Además, con algunas modificaciones en la técnica, las rebanadas de retina se pueden preparar a partir de otras especies en las que algunas de estas herramientas son más fáciles de obtener. Más allá de su utilidad para emparejado células enteras de grabación, la preparación rebanada retina salamandra también es susceptible a una variedad de otros enfoques. Como se discutió anteriormente, las rebanadas de retina se pueden utilizar para estudiar respuestas de la luz en combinación con diferentes protocolos de fijación de voltaje 17. Neuronas de la retina también se pueden cargar con colorantes fluorescentes sensibles a Ca 2 +, Cl -, o Na+ Introducida a través de la pipeta de parche o de baño-aplicación 15,18-20. Un péptido fluorescente que se une a la cinta sináptica 21 puede ser introducido a través de la pipeta de parche y se utiliza para obtener imágenes de la cinta 10 o, cuando se conjugan con fluoresceína, de forma aguda y dañar selectivamente la cinta 22. También hemos utilizado rebanadas de retina en combinación con los puntos cuánticos para vigilar los movimientos de los canales de calcio individuales en la barra y cono terminales sinápticos 23. Por lo tanto, la rebanada de la retina vertical es una preparación experimental versátil para el estudio de mecanismos sinápticos básicas y las funciones de procesamiento únicas realizadas en la primera sinapsis en la vía de señalización visual.

<table><tbody><tr><td>Cortadora de pañuelos</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de doble filo</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de nitrocelulosa</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>Tipo AAWP 0,8 mm poro</td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1,2 mm de diámetro exterior 0,95 mm ID</td></tr><tr><td>Pellet de Ag/AgCl</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>calibre 34 Aguja de llenado, 67 mm de largo</td></tr></tbody></table>

simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina anfibios

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Una de las tareas centrales de la neurociencia retina es entender los circuitos de neuronas de la retina y cómo esas conexiones son responsables de la formación de las señales transmitidas al cerebro. Los fotones se detectan en la retina por conos y bastones fotorreceptores, que convierten esa energía en una señal eléctrica, la transmisión a otras neuronas de la retina, donde se procesa y se comunica a los objetivos centrales en el cerebro a través del nervio óptico. Importantes primeros conocimientos sobre circuitos de retina y el procesamiento visual vinieron de los estudios histológicos de 1,2 Cajal y, más tarde, a partir de los registros electrofisiológicos de la actividad adición de células ganglionares de la retina - las células de salida de la retina 3,4. Una comprensión detallada de procesamiento visual en la retina requiere una comprensión de la señalización en cada paso en la vía de fotorreceptores a células ganglionares de la retina. Sin embargo, muchos tipos de células retinianas son fresaied profunda en el tejido y por lo tanto relativamente inaccesible para el registro electrofisiológico. Esta limitación se puede superar mediante el trabajo con las rebanadas verticales, en el que las células que residen dentro de cada una de las capas de la retina son claramente visible y accesible para el registro electrofisiológico. Aquí se describe un método para la fabricación de secciones verticales de retinas de larvas salamandras tigre (Ambystoma tigrinum). Mientras que esta preparación fue desarrollado originalmente para grabaciones con microelectrodos afilados 5,6, se describe un método para grabaciones de doble fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden en el que manipulamos potencial de membrana del fotorreceptor durante la grabación simultánea de post- las respuestas sinápticas en células horizontales o bipolar. Los fotorreceptores de la salamandra tigre son considerablemente más grandes que los de las especies de mamíferos, haciendo de ésta una preparación ideal en el que para llevar a cabo tsu enfoque experimental técnicamente difícil. Estos experimentos se describen con miras a sondear las propiedades de señalización de la cinta sináptica - una estructura sináptica especializada que se encuentra en un sólo un puñado de neuronas, incluyendo bastones y conos fotorreceptores, que es muy adecuado para el mantenimiento de una alta tasa de liberación de neurotransmisores tonic 7 , 8 - y cómo contribuye a las propiedades únicas de señalización de esta primera sinapsis retina.

Rastros representativos de respuestas de la luz de las neuronas en rodajas verticales de salamandra retina se muestran en la Figura 3. El cono, célula horizontal, y OFF células bipolares todas muestran una corriente hacia el exterior en respuesta a la aparición de la luz. El destacado corriente de entrada después de la luz del flash en las grabaciones de células horizontales y bipolar es causado por el aumento de la liberación de glutamato de los fotorreceptores como despolarizan en el desplazamiento de luz. El EN célula bipolar responde con una corriente de entrada al inicio de la luz como resultado de una metabotrópicos signo inversora receptor de glutamato cascada de señalización y activación de TRPM1 canales 9. Células horizontales y células bipolares se pueden distinguir una de otra por su relaciones IV (Figura 4). Células horizontales tienen típicamente una resistencia de entrada lineal o dentro rectificar IV y bajo (&lt;500 mW; Figura 4A) mientras que las células bipolares tienen una alta resistencia de entrada(0,5-2 GΩ) y hacia el exterior-rectificar I - V (Figura 4B) Figura 5 muestra resultados representativos de grabaciones de un par de células de cono horizontal (Figura 5A) y el par de células bipolares cono-apagado (Figura 5B).. En cada uno, el cono despolarizante a -10 mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV evocó una corriente en el cono y la EPSC rápida hacia el interior en la celda horizontal o bipolar de calcio dependiente de voltaje. Esta fuerte estímulo es suficiente para vaciar la piscina fácilmente liberable de vesículas ~ 20 de cada cinta sináptica, lo que resulta en una EPSC de ~ 47 pA / de la cinta 10. El EPSC celular horizontal en la Figura 5A fue de 232 pA, lo que sugiere que recibió 5 contactos planos de la cono presináptica. Una estimación similar del 178 pA EPSC en la célula bipolar off (Figura 5B) sugiere que recibió 4 contactos planos del cono presináptica. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Anfibios salina </td><td> Pipeta presináptica </td><td> Pipeta Postsináptica </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutamato * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconato ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Cloruro de tetraetilamonio </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mM </td><td> 9 mM </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolaridad **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamato se hace mediante la neutralización mM de ácido L-glutámico 40 con 40 mM de CsOH en la solución de la pipeta. ** Una de stock 1 M de Cs-gluconato se hace mediante la neutralización de una solución de CsOH con ácido D-glucónico 45-50%. *** El pH debe ser ajustado con NaOH para la solución extracelular y CsOH para las soluciones de pipeta. **** Mantener la osmolaridad de las soluciones de pipeta justo por debajo de la de la solución extracelular impide la hinchazón celular y mejora la longevidad de la grabación. Tabla1. Componentes y parámetros para las soluciones intracelulares y extracelulares estándar utilizados en este protocolo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño de la cámara de grabación. (AC) Arriba, al lado, y las vistas de corte de la cámara de registro que muestra las dimensiones. La cámara está fabricada en una pieza de espesor 2 mm de acrílico. (D) cámara de ensamblado. Superfusate entra en la cámara a través de una longitud de 10 cm de un tubo de Teflón (tubo de entrada; tipo 24LW). Superfusate se elimina mediante la aplicación de succión leve a un tubo de metal de calibre 20 biselado en el otro lado de la cámara. Adyacente a este tubo de salida es un electrodo de referencia de pellets de Ag / AgCl. La ventaja de este electrodo de referencia está conectado a la entrada de referencia de la headstage. Un pequeño triángulo de KIMWIPEse coloca sobre el electrodo de referencia para mantenerla en contacto con la solución y regular el flujo de la solución en el tubo de flujo de salida. La base de la cámara se forma mediante la colocación de un portaobjetos de microscopio de vidrio en los bordes hendidos de la cámara. La presentación se celebró en el lugar con una gota de grasa de vacío. Las tiras de membrana de nitrocelulosa con rodajas de la retina están incrustados en las gotas de grasa de vacío que forman un canal para la solución de flujo. Antes de hacer las rebanadas, un x 10 mm trozo de membrana de nitrocelulosa 5 se fija a la cámara con dos pequeñas gotas de grasa de vacío. Un pedazo de la ojera se coloca lado vítreo abajo en esta membrana de nitrocelulosa y se levanta lejos una vez que se adhiere la retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figura 2. Parejas de células llenas de tinte en verebanada preparación rtical. A) Imágenes de una barra y células horizontal sinápticamente de acoplamiento que se llena de contraste tintes fluorescentes introducidas a través de la pipeta parche durante la grabación simultánea de células enteras. Lucifer amarillo (2 mg / ml) se incluyó en la solución de la pipeta varilla (amarillo) y sulfarhodamine B (1 mg / ml) se incluyó en la solución de la pipeta celular horizontal (púrpura). Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipado con una cámara CCD enfriada (Orca ER) y montado en el microscopio de platina fija (Nikon E600 FN con 60X, 1,0 NA objetivo de inmersión en agua). Estas imágenes fueron superpuestas sobre las imágenes de campo claro de las rebanadas de retina correspondientes usando Adobe Photoshop. B) Imágenes de un cono y sinápticamente acoplados APAGADO célula bipolar. El axón terminal celular bipolar se ramifica en el sublamina exterior (S1) de la capa plexiforme interna cerca de la frontera con la capa nuclear interna. <strong&gt; C) Las imágenes de un cono y celular horizontal sinápticamente de acoplamiento. Tenga en cuenta que los terminales de cono son considerablemente más grande que el terminal del axón de la varilla. Aunque las células horizontales se pueden identificar por la forma oblonga de sus cuerpos celulares, los cuerpos celulares de la EN-y las células bipolares de tipo APAGADO en la INL no pueden distinguirse fácilmente antes de la grabación. Sin embargo, uno puede apuntar desplazados cono expulsados ​​de las células bipolares que tienen los cuerpos celulares de las ONL y se pueden distinguir de los conos por la ausencia de segmentos internos y externos. La barra de escala es de 20 micras. <img alt="Figura 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figura 3. Corrientes registradas bajo la abrazadera de voltaje de cuatro neuronas retinianas diferentes en respuesta a una brillante 500 ms destello de luz blanca de luz evoca. El cono (A), células horizontales <strong&gt; (B), y fuera de la célula bipolar (C) todos respondieron a la luz con una corriente hacia el exterior. (D) en la celda bipolar responde a los mismos estímulos de luz con una corriente hacia el interior. El ruido de la línea de base expuesta por la célula bipolar off (C) refleja una liberación continua de las vesículas sinápticas en la oscuridad que disminuye cuando los fotorreceptores hiperpolarizan a la luz. Se obtuvieron respuestas de estos cuatro celdas en las grabaciones separadas utilizando rebanadas preparadas con luz blanca. La intensidad del estímulo luminoso blanco utilizado en estos ejemplos produjo respuestas en las células bipolares y horizontales equivalentes a 580 nm flujo de fotones de 1 x 10 5 fotones / seg / 2 micras. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> La Figura 4. Relaciones corriente-voltaje (IV) de hcélulas bipolares orizontal y apagado. (A) Panel superior, corrientes de membrana evocadas por una serie de voltaje 150 mseg -120 a 40 mV aplicado en incrementos de 20 mV (panel inferior) a una célula horizontal. Células horizontales tienen típicamente una resistencia de entrada baja y relaciones lineales o dentro rectificar IV. (B) relación IV de una célula bipolar fuera en respuesta a una serie de pasos de voltaje. Células bipolares tienen una mayor resistencia de entrada y un IV de rectificación hacia el exterior, debido a la activación de las corrientes de potasio dependientes de voltaje. <img alt="La figura 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplos de registro de datos apareados. (A) Registro de la corriente de calcio dependientes de voltaje de cono (Cono I Ca </sub&gt;) en respuesta a una mseg paso 100 a -10 mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV (Cono V m). De fugas y la capacitancia transitorios fueron restados utilizando un protocolo de sustracción de fugas P / 8. Una rápida corriente excitatoria post-sináptica (EPSC; HC PSC) se registró de forma simultánea desde una célula horizontal, que muestra que estos dos células están acoplados sinápticamente (B) Un EPSC se registró en una célula bipolar fuera en respuesta al mismo estímulo en otro. cono.

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) Y explicamos cómo usamos estos sectores para estudiar la actividad sináptica de la retina mediante la obtención de dos grabaciones de fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden.

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de tejido delgado de retina de salamandra tigre acuática y usarlos para registros simultáneos de pinza de voltaje de células completas de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden. Esto se logra diseccionando primero el ojo de una salamandra y aislando la retina en un trozo de membrana de nitrocelulosa. El segundo paso es cortar trozos finos de retina y colocarlos en la cámara de grabación.A continuación, la cámara se coloca en un microscopio de platina fija vertical y se colocan pipetas de parche sobre los cortes de retina. El paso final es obtener grabaciones de células completas de una célula presináptica, fotorreceptora y postsináptica horizontal o bipolar. En última instancia, las grabaciones de células enteras emparejadas se pueden utilizar para manipular la liberación sináptica y estudiar las interacciones entre las células de la retina.La preparación de corte de retina se desarrolló originalmente en los laboratorios de Frank Werblin y Sam Wu.A diferencia de las preparaciones de una sola célula, las preparaciones de corte mantuvieron intacto el contacto ntic, y a diferencia de las preparaciones de retina de montaje completo, el corte de la retina expone varias capas de retina, lo que permite un acceso rápido a todos los diferentes tipos de células. En la retina Slice. Las preparaciones se pueden utilizar para registros electrofisiológicos, incluido el registro simultáneo para múltiples células y para experimentos de imagen.Esta preparación ha demostrado ser extremadamente valiosa para estudiar las interacciones sinápticas entre las neuronas de la retina. En este video, describimos la preparación de lonchas con retina de salamandra tigre y enfatizamos algunos de los pequeños detalles que pueden marcar la diferencia entre el éxito y el fracaso. Comience este procedimiento ensamblando la cámara.Coloque dos gotas de grasa al vacío espaciadas entre ocho y 10 milímetros a lo largo de la cámara de grabación para formar un canal para la superfase e incrustar las rodajas de retinol en un segundo golpe de grasa, unos milímetros más allá de cada una de estas dos gotas de grasa para actuar como un gravamen para limitar el derrame. A continuación, coloque un pequeño trozo triangular de toallita Kim en el extremo de la cámara para asegurar el contacto del fluido con el electrodo de referencia. Después de eso, presione un trozo de membrana de nitrocelulosa contra el microscopio de vidrio.Deslice sobre dos pequeñas gotas de grasa al vacío. Para preparar la cortadora de pañuelos. Rompe una hoja de afeitar de doble filo en cuatro pedazos.A continuación, fije uno de ellos al brazo de corte. Asegúrese de que el filo de la hoja de afeitar quede plano contra la cámara de grabación cortando una rodaja fina de papel de filtro de nitrocelulosa. A continuación, después de sacrificar a una salamandra por decapitación, nuclear el ojo con un par de pequeñas tijeras de Venecia bajo el microscopio, cortar la piel que conecta el ojo con la órbita circundante.A continuación, tire del ojo hacia delante y deslice las tijeras por debajo de él para cortar los músculos oculares y el nervio óptico. Después, coloque el ojo enucleado sobre un lecho de algodón sobre un bloque de linóleo. Ahora haga una pequeña incisión en el centro de la córnea con una cuchilla quirúrgica afilada.Retire la córnea deslizando las finas tijeras Venice en la incisión y extendiendo el corte radialmente hacia el aura Serrata. A continuación, corte circunferencialmente alrededor del aura serrata girando el bloque de linóleo o el algodón entre los cortes. Después de cortar todo el contorno del ojo, retire la córnea y el cristalino tirando de ellos hacia afuera del costado de la copa del ojo.Transfiera la copa ocular restante a una superficie dura del bloque de linóleo humedecida con solución salina de anfibios. Córtalo en tercios con una cuchilla de afeitar afilada con un movimiento de sierra fino para asegurarte de que corte todo el camino a través de la esclerótica. A continuación, coloque una o dos piezas de IUP en la membrana de nitrocelulosa con la superficie de la retina hacia abajo.Sumerge las piezas restantes con solución salina adicional. Después de eso, colóquelos en un refrigerador en caso de que se corten rebanadas adicionales más tarde. Ahora, presione suavemente la pieza de IUP contra la membrana de nitrocelulosa con un par de pinzas finas.Sumerge la membrana de nitrocelulosa y la pieza de IUP con varias gotas de solución salina fría de anfibios. A continuación, drene la solución salina tocando un trozo de toallita Kim en los bordes de la membrana de nitrocelulosa y el iup. Después de eso, sumerja el IUP en la membrana de nitrocelulosa con varias gotas de solución salina fría para anfibios.De nuevo, posteriormente se despega el epitelio pigmentario de la retina coroidea de la esclerótica para aislar la retina. Si la retina no se ha adherido firmemente, drene la solución salina con una toallita kim. Para tirar de la retina más firmemente sobre la membrana de nitrocelulosa, reemplace la solución salina y repita el procedimiento si es necesario.A continuación, llene la cámara con solución salina fría para anfibios. Transfiéralo a la etapa de la cortadora de pañuelos. A continuación, corte la retina y la membrana de nitrocelulosa en tiras finas de 125 micras presionando la hoja de afeitar suave pero firmemente a través de ellas.Después de cortar toda la retina en rodajas, transfiera las rebanadas de retina una por una al canal principal de la cámara de grabación. Para transferir una rebanada, sostenga una tira de membrana en su lugar mientras desliza la cámara debajo de ella. Asegúrese de mantener la rebanada sumergida cuando esté por encima de la parte central de la cámara.Incruste los bordes de la membrana de nitrocelulosa en las tiras de grasa al vacío y gírela 90 grados. Para ver las capas de la retina, presione la membrana de nitrocelulosa contra la superficie del vidrio, incluso si no hay retina en cada pieza. Coloque tiras de membrana de nitrocelulosa a intervalos regulares de aproximadamente milímetros para ayudar a romper la tensión superficial y, por lo tanto, mejorar el flujo de fluido.Continúe transfiriendo las rodajas una por una hasta que las rodajas se hayan colocado a lo largo de toda la longitud del canal de perfusión. Una vez que se hayan transferido todos los cortes, mueva la cámara de registro a la etapa de un microscopio de etapa fija vertical. Conecte el cable del electrodo de referencia a un cable de tierra en la etapa del cabezal del amplificador.Concéntrese en las rodajas utilizando un objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo de 40 a 60 veces. Siguiente súper. Fusionar las rodajas a una velocidad de un milímetro por minuto con solución salina de anfibios burbujeada con oxígeno.Conecte la línea de succión a la línea de salida de la cámara. A continuación, ajuste el caudal de salida para equilibrar el caudal de entrada girando el extremo biselado de la aguja de succión o moviendo la toallita kim en el extremo de la cámara más cerca o más lejos de la abertura en la punta de la aguja de salida. Examine las rodajas bajo luz tenue o infrarroja.A continuación, identifique un par de células, un fotorreceptor y una célula horizontal o bipolar cercana para su venta al por mayor. Grabación de la pipeta Philip preparada antes de los experimentos con la solución intracelular, móntela en el soporte de electrodos. A continuación, eleve ligeramente el objetivo del microscopio.Coloque la pipeta fotorreceptora debajo del objetivo. A continuación, bájalo para que la punta quede justo encima de la rebanada y ajusta el enfoque simultáneamente. Para evitar ir demasiado lejos.Repita este procedimiento con la segunda pipeta. A continuación, compruebe la resistencia de la pipeta con un pulso de despolarización de cinco a 10 milivoltios. Ajuste cualquier desplazamiento en el nivel de corriente de referencia en el amplificador.Después de eso, aplique una ligera presión positiva y, mientras tanto, coloque la pipeta postsináptica de modo que entre en contacto con el cuerpo celular horizontal o bipolar. A continuación, coloque la pipeta presináptica de modo que entre en contacto con el cuerpo celular de un fotorreceptor de bastones o conos. Mientras monitorea la liberación de resistencia, la presión positiva en la pipeta postsináptica, a veces la liberación de presión positiva es suficiente para formar un sello de giga ohmios.Después de que la resistencia de la punta haya aumentado a más de 100 mega ohmios, aplique un potencial de retención de menos 60 milivoltios. Luego, cuando se obtiene un sello giga om, cancele el transitorio de capacitancia de la pipeta. Usando el circuito de compensación de capacitancia del amplificador de abrazadera de parche, repita el procedimiento de techo con la pipeta fotorreceptora, aplicando un potencial de retención de menos 70 milivoltios y cancele la capacitancia de la pipeta.Transitorio, luego rompa el parche aplicando succión a cada celda. La ruptura del parche es evidente por la aparición de transitorios de capacitancia de celda completa. Ahora, confirme la identidad fisiológica de la célula postsináptica aplicando un destello de luz y entregando una serie de pasos de voltaje de menos 120 a más 40 milivoltios en incrementos de 20 milivoltios.Para evaluar si las celdas están conectadas sinápticamente, suministre un 60 milivoltio de 25 a 100 milisegundos. Despolarización escalonada al fotorreceptor y búsqueda de corrientes postsinápticas. En la neurona de segundo orden, aquí están los rastros representativos de las respuestas a la luz de las neuronas en cortes verticales de la retina de la salamandra.La célula horizontal del cono y la célula bipolar apagada muestran una corriente hacia el exterior en respuesta al inicio de la luz. La prominente corriente interna que sigue al destello de luz en las grabaciones de células horizontales y bipolares aquí es causada por el aumento de la liberación de glutamato de los fotorreceptores a medida que se despolarizan al compensar la luz. La célula bipolar responde con una corriente hacia adentro al inicio de la luz, que resulta de una cascada de señalización del receptor de glutamato metabotrópico que invierte el signo y la activación de los canales tripm one.Las celdas horizontales y las celdas bipolares se pueden distinguir entre sí por sus relaciones de voltaje de corriente. Las celdas horizontales suelen tener relaciones de voltaje de corriente lineales o rectificadoras hacia adentro con una resistencia de entrada inferior a 500 mega ohmios, las celdas bipolares tienen una relación de voltaje de corriente rectificadora hacia afuera y una resistencia de entrada más alta entre 0,5 y dos giga ohmios. Esta figura muestra los resultados representativos de los registros de un par de células horizontales de cono y un par de células bipolares de cono.En cada caso, la despolarización del cono a menos 10 milivoltios desde un potencial de retención de menos 70 milivoltios evocó una corriente de calcio dependiente de voltaje en el cono y un rápido postsináptico hacia adentro. Corriente en la célula horizontal o bipolar Corte de retina. Las preparaciones se han utilizado en cientos de estudios sobre la anatomía y la fisiología de la retina.Son particularmente ventajosos para examinar las respuestas de varias células simultáneamente, ya que facilitan el registro y la obtención de imágenes de varias células al mismo tiempo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar la retina, cortar cortes delgados de retina, colocarlos en la cámara de grabación y obtener grabaciones al por mayor de pares de seres conectados sinápticamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

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