Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

다음 실험의 전반적인 목표는 제브라피시 자가 종양 모델을 사용하여 흑색종 변형자를 스크리닝하는 것입니다. 이것은 멜라닌 세포가 관심 유전자를 발현하고 물고기가 흑색종에 걸리기 쉬운 형질전환 동물을 만들어 달성됩니다. 다음으로, 관심 유전자가 종양 시작을 변경하는지 여부를 평가하기 위해 흑색종 발병을 점수화합니다.

그런 다음 종양 침입 및 세포 특이적 분석을 수행하여 흑색종 및 전악성 멜라닌 세포에 대한 관심 유전자의 추가 영향을 확인합니다. 마지막으로, 관심 유전자가 확립된 종양에서 흑색종 시작 세포의 빈도에 어떤 영향을 미치는지 측정하기 위해 흑색종 세포를 이식합니다. 결과는 후보 유전자가 발병 침입 및 이식 능력을 포함하여 멜라닌 세포와 흑색종의 다양한 특성에 어떻게 영향을 미치는지를 보여줍니다.

후보 암 유전자 조사를 위한 생식계열 형질전환과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시간, 노력 및 비용이 절약되고 분석을 통해 처리량이 증가한다는 것입니다. 차임 형질전환 동물에서 종양 발생의 다양한 측면 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생인 셰라니아 한천이 주사를 위한 구조체를 생성하는 것입니다. PCR에 의해 게이트웨이 중간 진입 클론을 생성하고, 관심 유전자의 전체 길이 개방 판독 프레임을 증폭하고, P don R 2 21로 재조합하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 다중 사이트 게이트웨이 기술을 사용하여 관심 멜라닌 세포 특이적 mifa 프로모터 유전자 및 폴리아데닐화 신호를 미니 Cooper 벡터에 재조합하여 관심 유전자를 MIFA 프로모터의 제어 하에 배치하고, 각 클론의 25 피코그램을 TOL 2의 25 피코그램과 함께 주입합니다. 미파 브래프 FP 53. 돌연변이 동물은 멜라닌 세포가 결핍되어 변형과 흑색종이 형성되기 쉽습니다.

관심 유전자와 함께. mini Cooper 벡터는 recuring MVA mini gene을 포함하고 있습니다. 따라서 성공적으로 주입된 동물은 관심 유전자를 발현하는 구조된 멜라닌 세포를 발달시킬 것입니다.

주입된 배아를 수정 후 24시간 동안 섭씨 28.5도에서 배양 또는 HPF를 배양합니다. 수정 후 72시간이 지나면 흰색 배경의 입사광 아래에서 해부 현미경을 사용하여 죽은 배아를 제거합니다. 구조된 멜라닌 세포가 있는 형질전환 동물을 선택합니다.

동물이 수정 후 4일이 되면 제브라피시 시설의 보육원에 있는 3리터 탱크로 옮깁니다. 생후 2개월이 되면, 멜라닌 세포 구조 영역이 4mm 제곱 이상 되는 동물을 선택합니다. 매주 선택한 동물을 검사하여 종양의 존재 여부를 확인합니다.

연구를 위해 종양이 있는 동물을 분리하십시오. absa에서 연령(주)에 따른 흑색종 무함유 생존 곡선을 그리고 세로좌표에 흑색종 무함유 생존율을 그립니다. EGFP와 멜라닌 세포를 발현하는 대조 동물을 대조하기 위해 관심 유전자를 발현하는 멜라닌 세포와 비교합니다.

로그 순위 검정을 사용하여 두 곡선이 통계적으로 다른지 여부를 확인할 수 있습니다. 종양 침습 분석을 수행합니다. 뒷뇌의 후방 경계와 등지느러미의 전방 경계 사이의 영역에서 등쪽에 종양이 발생하는 고립된 얼룩말 물고기를 선택하는 것으로 시작합니다.

흑색종 발병 2주 후, 트리카를 사용하여 생선을 파라핀에 고정하고 삽입한 후 물고기를 안락사시킵니다. 병변을 통해 5마이크로미터 횡단면을 만듭니다. 1. 50마이크로미터마다 전체 병변을 절단하여 가장 깊은 침범 지점을 식별할 수 있습니다.

hematin과 eoin을 사용하여 섹션을 염색하십시오. 종양 세포가 콜라겐 층 밖에 남아 있는지, 등쪽 근육 조직으로 침범하는지, 척추 내로 더 깊이 침범하는지 여부를 측정하여 종양 침습을 평가합니다. 면역 염색을 수행하기 위해 두 샘플 세트 간의 통계적 차이를 측정합니다.

해부 현미경으로 입사광으로 트리카 밀리리터당 0.17mg으로 물고기를 마취합니다. 날카롭고 가느다란 끝이 있는 집게를 사용하여 등쪽 비늘을 뽑습니다. 스케일의 절반을 포함하는 멜라닌 세포가 손상되지 않도록 주의하십시오.

집게에서 직접 스케일을 1ml의 고정제에 넣고 실온에서 2시간 이상 뒤집으면서 배양합니다. 물고기를 물고기 물에 옮기고 물고기를 모니터링하여 색소 침착 멜라닌 세포의 성공적인 회복을 확인합니다. 먼저 PBST의 고정 저울을 실온에서 5분 동안 두 번 세척합니다.

다음으로, 갓 만든 표백제 용액 1ml를 넣고 퍼퓸 또는 캡 잠금 장치로 덮어 가스가 튜브가 터지는 것을 방지합니다. 색소가 사라질 때까지 표백을 계속하십시오. 그런 다음 실온에서 5분에 4회 PBST로 세척합니다.

블록 용액에서 최소 30분 동안 배양한 다음 약 400마이크로리터의 1차 항체 및 블록 용액으로 하룻밤 동안 실온에서 배양하고 실온에서 PBS에서 30분 동안 저울을 3회 세척하고 실온에서 2시간에서 하룻밤 동안 2차 항체로 배양합니다. dpi로 서 있는 후 유리 슬라이드에 벡터 쉴드 한 방울을 바르고 비늘의 오목한 면이 슬라이드에 대해 아래를 향하도록 비늘을 장착합니다. 샘플 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.

투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 방사선 투여를 받은 후, 생후 2-3개월 된 캐스퍼 피쉬는 이식 하루 전에 25개의 회색 감마선을 조사합니다. 물고기가 물고기 물에서 회복할 수 있도록 합니다.

트리카를 사용하여 종양이 있는 물고기를 안락사시키고, 종양을 잘라낸 다음 약 5밀리리터의 페트리 접시에 0.9 XPBS(5% FBS로 멸균)를 넣은 후 용액에서 실온에서 작업하고 P 1000 피펫으로 반복하여 단일 세포를 생성하는 동안 종양을 면도칼로 깍둑썰기합니다. 볼륨을 25밀리리터로 올립니다. 40마이크로미터 메쉬 필터를 통해 용액을 여과하고 453RCF의 탁상용 원심분리기에서 10분 동안 회전합니다.

펠릿을 0.9%PBS, 5%FBS에서 원하는 농도로 다시 현탁시킵니다. 혈액 세포분석기를 사용하여 정확한 세포 수를 계산하고 최종 주입 부피가 약 5마이크로리터가 되도록 세포 현탁액을 희석합니다. 예를 들면, 50의 000의 세포가 주사될 것인 경우에, 세포 현탁액은 10의 마지막 농도, 마이크로리터 당 000의 세포에 묽게 되어야 한다.

세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 몇 분마다 튕겨 100% 에탄올과 0.9 XPBS로 세포가 뭉치는 것을 방지합니다. 26 s 게이지 베벨 팁 7, 0, 1 및 10 마이크로 리터 Hamilton 주사기를 2-3 회 세척 한 후 주사기에 5 마이크로 리터의 세포 현탁액을 장전합니다. 방사선 조사된 수혈 피쉬를 트리카에 마취한 후, 젖은 킴 물티슈에 옆으로 눕힌다.

한 손으로 물고기를 안정시키고 베벨이 45도 각도를 향하도록 바늘을 복막강 위의 물고기 측면에 삽입합니다. 뒷뇌의 후방 경계와 등지느러미의 전방 경계 사이의 약 중간. 플런저를 부드럽게 누릅니다.

물고기가 민물고기 물에서 회복되도록 하고 종양 생착을 위해 매일 물고기를 관찰하십시오. 생착이 발생한 경우 지속적인 성장과 질병 발생도 관찰할 수 있습니다. 1개의 세포 BRAF FP 53 MIFA 제브라피쉬 배아에 흑색종 발암유전자 세트 DB 1 또는 EGFP를 각각 포함하는 미니 쿠퍼 벡터를 본 명세서와 같이 MFA 프로모터의 제어하에 주입하였다.

성인의 종양 발생률 곡선은 여기에서 볼 수 있듯이 SET DB one이 EGFP 대조군에 비해 흑색종 발병을 현저히 가속화하는 것으로 나타났으며, 헤마틴 및 EOSIN 염색은 SET DB one을 발현하는 흑색종이 EGFP 대조군 흑색종보다 국소 침습성이 더 높았음을 보여줍니다. 이 그림은 종양의 이식 능력을 평가하기 위해 핵 국소 mifa 전사 인자를 인식하는 항체로 염색된 표백되거나 표백되지 않은 제브라피시 등쪽 비늘을 보여줍니다. 흑색종 세포는 BRAF FP 53 미파 피쉬에서 분리하여 미니 컵 R-E-G-F-P 50을 주입하고, 000 세포를 전날 방사선 조사한 수용자 캐스퍼 돌연변이체에 피하 주사하여 25 개의 회색을 여기에서 볼 수 있듯이 여기에서 볼 수 있습니다.

색소화된 공여체 유래 세포는 쉽게 인식되었습니다. 따라서 개발 후 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시를 사용하여 흑색종과 관련된 유전적 변화의 기능적 결과를 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 자동 종양 모델을 사용하여 분석을 통해 흑색종 조절자를 스크리닝하는 방법, 종양 발병 침습, 유전자 발현 및 이식 능력의 차이를 잘 이해할 수 있을 것입니다.