Name: 글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 키네신 구동 글라이딩 분석법을 사용하여 미세소관의 굽힘 강성을 측정하는 방법을. 형광 현미경으로 개별 미세소관의 지속 길이를 실험적으로 결정하고 세포골격 역학을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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우리는 지원이 프로토콜을 시연을 위해 그림 1과 안나 Ratliff를 준비 멜리사 Klocke 감사드립니다. 이 작품은 과학 발전을위한 연구 법인에 의해 지원되었다.

1. 미세 소관 글라이딩 검정 주식 솔루션 앞서 글라이딩 분석의 준비. <ol><li> 띄엄 띄엄 밝은 유기 형광 22 분류 0.5 MG의 미소를 중합. 대상 레이블 농도가 1 마이크로 미터 미세 소관의 당 형광, 또는 1500 tubulin의 dimers 당 약 1 형광의 라벨 밀도입니다. 객실 온도, 빛의 저장소가 최대 두 주를 위해 알루미늄, 호일로 보호되고 있습니다. </li><li> 약 1 μM에서 비오틴 - kinesin 21 정화. -80에서 저장 ° C 각각의 실험에 사용 5 μl aliquots 인치 </li><li> 50 밀리미터 imidiazole의 분석 버퍼 (AB), 50 MM의 칼륨 염화물 (KCl), 4 밀리미터 염화 마그네슘 (MgCl 2), 2 MM 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA), pH를 6.7를 준비합니다. 4에 살균 필터 및 저장 ° C. </li><li> 2 밀리그램 / AB의 ML에 biotinylated 소 혈청 알부민 (BSA 비오틴 -)을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다.-80에서 스토어 4에 오랜 기간 100 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 1 개월하십시오. </li><li> 10 MG / AB의 ML에 streptavidin (SA)을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다. -80에서 매장까지 2 주에 ° 4에 오랜 기간 20 μl aliquots에서 C, ° C. </li><li> 5 AB의 MG / ML에 α-카제인을 분해. 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링 할 수 있습니다. -80에서 스토어 4에 오랜 기간 100 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 2 주에. </li><li> 200 MM의 탈 이온수에 dithiothreitol (DTT)을 분해. 100 μl aliquots에서 -20 ° C에서 스토어는, 해동 8 시간 이내에 사용합니다. refrozen 할 수 있습니다. </li><li> 4 MM에서 HPLC 급 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 paclitaxel (PT)을 분해. -80 10 μl aliquots에 저장 ° C 장기적으로, -20 ° C 단기. 해동 8 시간 이내에 사용하십시오. refrozen 할 수 있습니다. </li><li> 120 MG / ML의 탈 이온수에서 포도당을 분해. -20 ° C. 100 μl aliquots에 저장 refrozen 할 수 있습니다. </li><li> 비밀입니다150 음, 산도 7.0에서 탈 이온수에 아데노신 삼인산 (ATP)를 해결. -80에서 5 μl aliquots에 저장 ° C는 해동 8 시간 이내에 사용합니다. </li><li> 600 μl 총 검정 버퍼에 카탈라아제 만 단위의 포도당 산화 효소와 156,000 단위를 용해하여 100x 산소를 청소 재고품 25 준비합니다. 펠렛 고체에 microcentrifuge에 간단히 원심 분리기, 0.2 μm의 주사기 필터 필터 표면에 뜨는. -80에서 스토어 4에 오랜 기간에 10 μl aliquots에서 ° C, ° C까지 일주일하십시오. </li></ol> 2. 미세 소관 글라이딩 검정, 당일 솔루션 준비 실험 당일 2.1-2.6의 솔루션을 준비합니다. 연습으로, 솔루션 2.2-2.6는 흐름 세포 세척 동안 준비 할 수 있습니다. 별도로 명시하지 않는 한, 얼음 재고 솔루션을 유지. <ol><li> DTT 주식의 10 μl (2 MM DTT와 AB)와 AB, 검정 버퍼 1 ML을 준비합니다. 실온에서 보관. </li><li> 바이오 BSA 버퍼, 40 &amp; 무 준비, 비오틴-BSA 주식과 AB의 1:1 혼합물의 리터. 실온에서 보관. </li><li> 5.5 μl BSA (AB 1 MG / ML BSA)과 AB의 645 μl를 혼합 BSA 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관. </li><li> 3 μl streptavidin 재고 (AB의 0.5 MG / ML streptavidin)와 AB의 57 μl를 혼합, SA 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관. </li><li> BSA 버퍼, 50 μl 카세인 재고 및 15 μM ATP (1 MG / ML α-카세인, 0.8 MG / ML BSA, AB에서 50 nm의 ATP)의 0.8 μl 200 μl를 혼합, α-카세인 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관. </li><li> 95 μl α-카세인 버퍼, 2.5 μl 포도당 재고, 1 μl 100x 산소 청소 믹스, 1 μl paclitaxel 재고, 1 μl 2 메르 캅토 에탄올을 (βME) 혼합, 형광 반 표백 버퍼를 준비합니다. 배기함에 넣고 βME을 추가합니다. 준비 1 시간 이내에 형광 반 표백 버퍼를 사용하여주의 :. βME은 높은 독성이며, 끔찍한 냄새. 만 배기함에 넣고 열해야합니다. 에 저장 병빛의 부재, 빛 βME과 photobleaching을 줄일 수있는 능력을 방해합니다. </li></ol> 3. 미세 소관 글라이딩 분석 <ol><li> 스페이서로 피펫 팁을 통해 주사기에서 압출 진공 그리스를 사용하는 24 X 60mm의 coverslip 22 X 22mm의 coverslip 사이 네 흐름 차선,에 대해 구성합니다. 각 흐름 차선는 볼륨의 약 10 μl (규모의 후속 권 따라)해야합니다. </li><li> 각 차선에 바이오 BSA 버퍼 10 μl을 씻는다. BSA는 코트의 유리 표면을 할 수 있도록 5 분 알을 품다. </li><li> 슬라이드 표면을 차단하는 계속하는 동안, 비오틴-BSA 무료 제거 15 μl BSA 버퍼 각 차선을 세 번 씻으십시오. 공기 거품이 흐름 챔버 통과 할 수 있도록하지 않도록하는 것 흐름 챔버의 반대편에서 버퍼를 제거하는 Kimwipe 또는 거름 종이를 사용합니다. </li><li> 각 차선에 15 μl SA-버퍼를 씻으십시오. 10 분, 또는 최대 2 시간을 기다립니다. streptavidin는 표면에 바인딩 비오틴-BSA에 바인딩됩니다. </li><li> 슬라이드 표면을 차단하기 위해 계속하는 동안 무료로 SA를 제거하는 15 μl BSA 버퍼 각 차선을 세 번 씻으십시오. </li><li> 15 μl α-카세인 버퍼 각 차선을 씻는다. α-카세인은 또한 유리에 비 특정 kinesin의 구속하며 미소를 차단하는 데 도움이됩니다. </li><li> α-카세인 버퍼에서 10 나노 미터로 kinesin를 희석이 kinesin의 15 μl 각 차선을 씻고 - α-카세인 솔루션입니다. 표면에 바인딩 streptavidin에 구체적으로 바인딩 biotinylated kinesin 15 분 (또는 최대 한 시간까지) 기다립니다. kinesin 모터 도메인은 바인드 미소를 무료로 유지됩니다. </li><li> 방 온도 40 μM α-카세인 버퍼에 paclitaxel을 희석, 무료 kinesin을 씻어하고 depolymerizing에서 미소를 방지 할 수있는 paclitaxel 솔루션으로 각각의 흐름 챔버를 미리로드하려면이 솔루션의 15 μl 각 차선을 씻는다. 감기는 미소를 depolymerizes 때문에 방 temperatu로 실온에서 다음 단계가 발생했는지 확인솔루션을 다시. </li><li> 휘황 1 ㎜ ATP와 형광 안티 - 표백제를 버퍼에 미소 1:100-1:1,000이라는 희석. 한 차선에 15 μl을 씻고 30 분 이내에 관찰한다. </li></ol> 4. 데이터 수집 <ol><li> 형광 현미경을 사용하여 미소 글라이딩을 관찰, 이러한 상업적 또는 집에서 빌드 TIRF 설정과 같은 단일 fluorophores를 해결 할 수있는 현미경은 26 (그림 2)가 필요합니다. 미소는 온도에 따라 약 0.5 μm / s의 기판 위에 kinesin 모터에 의해 추진되어야한다. 현미경의 뷰 필드가 50 μm 경우, 각각의 미소는 약 100 초 동안 표시됩니다. 단일 fluorophores 더 빨리 100 초보다 photobleach하지 않도록 조명 강도를 설정합니다. 레이저 여기를 사용하는 경우, 약 3-5 MW의 전력 설정이 적합합니다. </li><li> 분석을위한 이미지의 시퀀스를 수집합니다. 600 이미지에서5 Hz에서 (2 분 총)는 잘 작동합니다. 충분히 미소는 전체 뷰 필드를 통과하는 시퀀스를 사용하십시오. </li></ol> 5. 데이터 분석 IDL 루틴, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro가</a> 첨부되어 있습니다. 이 루틴은 주어진 이미지 시퀀스의 모든 미소 글라이딩에 따라 지속성 길이 값을 반환합니다. 어느 특정 현미경 설정에 따라 강도 매개 변수를 수정, 각 이미지 시퀀스에서이 루틴을 실행하거나 다음을 수행하십시오 : <ol><li> 형광의 탄도를 만들 수있는 미세 소관에 부착 된 각각의 형광을 추적 할 수 있습니다. </li><li> 이미지 시퀀스의 각 미세 소관 (그림 3)을 반복, 전체 미세 소관 궤도에 주어진 미세 소관에 fluorophores의 모든 궤도를 결합합니다. </li><li> 궤적을 따라 각 지점의 접선 각도 (그림 4) 계산및 계산 &lt;cos θ S&gt; EQ 인치 (그림 5) 경로 길이 S로 구분하여 지점의 모든 쌍에 대한 각도 차이의 코사인을 평균하여 1. θ S&gt; EQ에 맞는 &lt;cos하여 미소의 단일 미세 소관 또는 그룹에 대한 지속성 길이를 찾습니다. 1 가중 평균을 계산하는 데 사용됩니다 왜냐하면 θ s의 독립적 인 값의 개수로 적합의 개별 데이터 포인트. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

지속성 길이 측정은 개별 biopolymers의 기계적 성질의 좋은 특성입니다. 이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이를 측정하는 방법을 설명합니다. 으로 도입에 명시된 바와 같이,이 방법은 쉽게 간단하게 글라이딩 검정, 3.9의 최종 단계에서 시약, 온도, 또는 점도를 변화하거나 polymerizing 미소, 스텝 1.1의 다양한 조건에 미세 소관 기계적 특성을 조사에 연장됩니다 다른 조건 하에서. 기술 자체는 수행 할 수 빠른 것입니다. 재고 솔루션은 미리 (1 단계)의 준비를 한 후 글라이딩 분석 실험은 단일 현미경 슬라이드에 조건 네 개의 변화 (단계 3.1의 네 개의 차선)까지 포함, 2-3 시간에 수행 할 수 있습니다. 많은 미소는 각 실험에서 검토 될 수있다; 우리 연구실에서 전형적인 실험 조건 당 100 미소 (약 10 이미지 sequenc을 검토순서 당 10 미소)와 차선 당 에스. 큰 데이터 세트의 분석 역시​​ 매우 빠른 것입니다. 연습으로, 10 이미...

세포 골격은 대부분의 진핵 세포에서 발견 biopolymers의 네트워크, 휴대 조직, 세포 내 수송과 세포 역학의 역할을합니다. 세포 골격 (주로 고를와 미소)의 biopolymers의 기계적 특성은 전체 12 세포의 기계적 특성을 결정에 중요한 역할을한다. 전체 세포 역학이 건강하고 병에 걸린 세포에게 13,14을 특성화 할 수 있으며 세포 운동성 15에 관여되어 있기 때문에, 기본 cytoskeletal 구성 요소의 기계적 성질은 지난 20 년 1 연구의 활성 영역했습니다. biopolymers의 유연성 (또는 강성)은 지속성 길이, 주위 온도에서 열 변동에 따라 약 방 사부에 의해 구부러 폴리머의 길이에 의해 특징입니다. 기술의 수는 examp에 대한 지속성 길이 16, 측정하기 위해 개발되었습니다유체 흐름, 광학 트랩, 또는 전기 분야 4,17,18, 및 솔루션 5,6에서 무료로 고분자의 변동을 측정 수동적 인 기술을 사용하여 폴리머를 절곡 참여 르중인 기술. 활성 측정 단, 전문 설정은 마이크로 미터 규모라고 힘을 구현하도록 요구하고, 자유 변동 측정은 사용 현미경의 초점 비행기의 확산 아웃으로 인해 도전 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 미소의 지속성 길이, cytoskeletal 폴리머를 측정 할 수있는 보완, 수동, 기술에 대해 설명합니다. 기술은 폴리머는 항상 19 초점 비행기에 남아 있도록 글라이딩 assays를 포함합니다. 또한,이 폴리머 따라 특정 위치가 잘 특징 있도록 관심 폴리머에 영구적으로 부착 된 추적 한 fluorophores을 포함합니다. 방법의 만화는 Figur에 표시됩니다E 1. Kinesin는 미소의 + 끝으로 구체적으로 이동하므로 글라이딩 분석에 미소가 unidirectionally 추진되어 있습니다. 미세 소관의 선두 끝은 첨부 마지막 kinesin 넘어, 주변 솔루션의 열 군사 변동 할 수있다. 미세 소관이 앞으로 추진되면서 끝은 유리 슬라이드를 따라 더 새로운 kinesin 분자에 바인딩 할 때까지 주어진 변동에 정지 다를 수 있습니다. kinesin가 매우 강력하게 미소를 연결하기 때문에, 미세 소관은 선도적 인 엔드의 경로를 따라 제한됩니다. 따라서 미세 소관 궤도에 냉동 통계 변동 미소 (11)의 자유 단의 통계 변동과 동일합니다, 따라서 20에 따라 지속성 길이를 계산하는 데 사용할 수 있습니다 <img alt="수식 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srC = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot;/&gt; 리터 P는 미세 소관의 지속성 길이이고, θ s이 (가) 등고선의 길이 S로 구분하여 궤도에 접선 사이의 각도이며, &lt;&gt; 존재라는 증거 윤곽 길이의로 구분하여 위치의 모든 쌍 이상의 평균. 글라이딩 분석 자체는 특별히 streptavidin - 비오틴의 연계를 통해 유리 슬라이드에 바인딩 된 코일 코일 21시 kinesin biotinylated 사용합니다. 이 첨부 파일은 모터 도메인에 바인딩하고 미소를 추진 자유롭게 보장합니다. 미세 소관의 탄도를 따라하기 위해, 미소가 띄엄 띄엄 유기 fluorophores 22,23으로 분류됩니다 - 라벨 하나 fluorophores는 단일 분자 형광 현미경을 사용하여 확인할 수있는 것을 충분히 희박한해야합니다. 싱글 fluorophores은 IDL로 작성된 이미지 분석 루틴을 사용하여 추적하고 있습니다. 각 형광의 궤도는 주어진 마이크에 바인딩rotubule은 자동으로 24 복합 미세 소관 궤도로 결합되어 있습니다. 궤도를 따라 각 지점에 θ 탄젠트 각도가 계산되며,이 접하는 각도에서 &lt;cosθ S&gt; 값이 각 등고선의 길이 s에 대한 계산됩니다. 마지막으로, 이러한 데이터는 EQ에 맞게되어 있습니다. 1 주어진 미세 소관에 대한 지속성 길이를 추출하기 위해, 또는 같은 글라이딩 분석에 많은 미소를위한. 방법은 조건의 다양한 (행 미세 소관 관련 단백질 (지도)이나 점성 솔루션의 다양한, 미세 소관에 바인딩 된 다른 안정화 대리인 또는 다른 작은 분자 포함)에서 조리 미소와 함께 일을 할 수있을만큼 강력합니다. 우리가 실험실에서, 기술은 다른 안정화 에이전트와 미소와 미소를 따라 길이의 함수로 미소의 지속성 길이를 특성화하는 데 사용되었습니다. 주요 제한은 미소는 여전히해야upport kinesin의 운동성. kinesin는 강력한 모터 효소이기 때문에이 상당히 느슨한 제한됩니다. 마이 오신 가족 효소를 고를와 kinesin과 미소를 대체함으로써, 고를의 지속성 길이가 같은 기술을 사용하여 측정 할 수 있습니다.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; 시약</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 이미 다졸</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 칼륨 염화물</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 염화 마그네슘</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; biotinylated BSA</td&gt;<td&gt; 열 과학</td&gt;<td&gt; 29,130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; α-카세인</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; streptavidin</td&gt;<td&gt; 열 과학</td&gt;<td&gt; 21,125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; dithiothreitol</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC 연구소</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 포도당 산화 효소</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 카탈라아제</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 포도당</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2 메르 캅토 에탄올</td&gt;<td&gt; 시그마 - 알드리치</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; 독성. 작은 금액을 구매합니다.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 mm 번호 1 1 / 2 커버 유리</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 mm 제 1 커버 유리</td&gt;<td&gt; 골드 인감</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 높은 진공 그리스</td&gt;<td&gt; 다우 코닝 -</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; 장비</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF 현미경</td&gt;<td&gt; 많은</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt;이 방법에 사용되는 TIRF 현미경은 집에서 만든이었습니다.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (소프트웨어)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt;는 MATLAB, ImageJ, 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어를 대체 할 수 없습니다.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

글라이딩 assays를 사용 biopolymers의 굽힘 강성 측정

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

미소는 cytoskeletal 세포 분열에 역할을 고분자, 세포 역학, 그리고 세포 내 수송 있습니다. 이 함수는 각각 뻣뻣하고 세포 직경의​​ 중요한 일부를 기간을 직선 충분 미소가 필요합니다. 그 결과, 미세 소관 지속성 길이, 강성의 측정은 적극적으로 지난 20 년 1 연구되었습니다. 짧은 미소 긴 미소 2-4보다 10-50 배 더 치열한 있으며, 심지어 긴 미소는 진도 5-9의 순서에 따라 다를 수 지속성 길이를 측정했습니다 그럼에도 불구하고, 오픈 질문이 남아있다. 여기, 우리는 미세 소관 지속성 길이를 측정하는 방법을 제시한다. 방법은 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석 10를 기준으로합니다. 미세 소관에 부착 된 개인 fluorophores의 단일 입자 추적, glidin과 개별 미소의 스파 스 형광 라벨을 결합하여하나 미소의 g의 탄도는 나노 미터 수준의 정밀도로 추적합니다. 궤도의 지속성 길이는 11 사용 조건에서 미세 소관의 지속성 길이와 동일합니다. 자동화 된 추적 루틴은 개별 미소에 첨부 fluorophores에서 미세 소관의 탄도를 만드는 데 사용되는,이 탄도의 지속성 길이를 IDL로 작성된 루틴을 사용하여 계산됩니다. 이 기술은 빠르게 implementable, 그리고 실험 하루에 100 미소의 지속성 길이를 측정 할 수 있습니다. 방법은 미소를 따라 길이의 함수로 지속성 길이 등의 다양한 조건 아래에서 지속성 길이를 측정하기 위해 확장 될 수 있습니다. 또한, 사용 된 분석 루틴은 잘 고를의 필라멘트의 지속성 길이를 측정하기 위해, 마이 오신 기반의 연기 글라이딩 assays로 확장 할 수 있습니다.

글라이딩 분석에서 스냅 샷은 그림 2에 표시됩니다. 좋은 미세 소관 밀도는 시야 당 1-10 미소이다; 미소가 서로 교차으로 실질적으로 더 많은 mistracking 될 것이다. 그림 2의 글라이딩 분석에서 11 미세 소관의 탄도의 플롯은 그림 3에 표시됩니다. 일반적으로 궤도는 10-30 μm 길이 한쪽 미세 소관이 서로 교차 곳을 몇 궤도는 차이가 있습니다. 이 궤도는 분석에서 삭제 될 수 있습니다. 하나의 긴 미세 소관 궤도가 궤도를 따라 두 위치에서 예를 들어 탄젠트 각도로 그림 4A에 표시됩니다. 고정 된 거리로 구분하여 탄젠트 각도 사이의 차이는 지속성의 길이에 관련되어, 미세 소관의 궤적을 따라 위치의 함수로 접하는 각도는 그림 4B에 표시됩니다. 탄젠트 각도 데...

지속성 길이 또는 biopolymers의 굽힘 강성을 측정 할 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 실험적으로 개별 미소의 지속성 길이를 결정하는 kinesin 기반 미세 소관 글라이딩 분석을 사용하고 고를 기반 글라이딩 assays에 적용 할 수 있습니다.

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

이 절차의 전반적인 목표는 글라이딩 분석을 사용하여 미세소관의 UAL 강성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 모터 단백질 kinesin을 미세소관에 자유롭게 결합할 수 있는 모터 도메인이 있는 현미경 슬라이드에 특이적으로 부착하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 형광 표지된 미세소관을 샘플에 추가하는 것이며, 이 미세소관은 kinesin에 의해 번역됩니다.다음 글라이딩 미세소관에 대한 비디오는 형광 현미경을 사용하여 수집됩니다. 마지막 단계는 미세소관 굴곡 강성을 계산하기 위해 글라이딩 분석 비디오를 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 글라이딩 분석법은 단일 미세소관의 굴곡 강성을 측정하는 데 사용됩니다.이 방법은 개별 세포골격 폴리머의 굽힘 강성과 같은 세포골격 역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학생인 Anna Ratliff입니다. 이 절차를 시작하려면 10마이크로리터의 200 milli mole, DIO, three atol 또는 DTT를 1ml의 스톡 분석 버퍼 용액에 첨가하고 혼합하여 작업 분석 버퍼를 준비합니다.절차 중에 이 솔루션과 다른 모든 작업 솔루션을 실온에 보관하십시오. 다음으로, 작업 분석 완충액을 사용하여 밀리리터당 2mg의 멸균 여과된 비오틴화 소 혈청 알부민과 작업 분석 완충액을 1:1 비율로 결합하고 용액을 혼합하여 40마이크로리터의 비오틴 BSA 완충액을 준비합니다. 그런 다음 645마이크로리터의 분석 버퍼와 5.5마이크로리터의 117밀리리터 BSA를 결합하고 용액을 혼합하여 BSA 버퍼를 준비합니다.또한 분석 완충액에서 57마이크로리터의 분석 완충액과 3마이크로리터의 멸균 여과된 연쇄상구균 din을 10mg당 10mg으로 혼합하여 트리틴 완충액을 준비합니다. 다음으로, 24 x 60mm 커버 슬립에 흐름 레인을 구성하고 10ml 주사기에서 5개의 얇은 진공 그리스 라인을 압출합니다. 흐름을 조절하기 위해 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 라인은 약 4mm 떨어져 있어야 합니다.진공 그리스 위에 22 x 22mm 커버 슬립을 놓고 가볍게 눌러 채널을 형성합니다. 대략 10마이크로리터의 부피로 진공 그리스 라인은 원래 너비의 약 두 배까지 퍼져야 합니다. 다음 단계는 10마이크로리터의 bioTE BSA 완충액을 모세관력을 사용하여 각 유동 레인에 피펫팅하여 실온에서 5분 동안 완충액을 인큐베이팅하여 비오틴화된 소 혈청 알부민으로 레인을 preco하는 것입니다.그런 다음 각 레인의 한쪽 면에 15마이크로리터의 BSA 버퍼를 주입하여 각 레인을 세 번 헹구고 Kim 와이프 또는 여과지를 사용하여 다른 쪽에서 용액을 빼냅니다. 차선에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 다음으로 15마이크로리터의 스트렙타비딘이 각 레인으로 완충되고 최소 10분으로 최대 2시간 동안 배양합니다.배양 중, 200 μl의 BSA 완충액 50 μl의 멸균 여과 된 알파 KC를 분석 완충액에서 ml당 5 밀리그램으로 혼합하고 pH 7에서 0.8 μl의 15 마이크로 몰 a TP를 혼합하여 완충액에서 알파 KC를 준비합니다. 또한 알파 KCM 완충액을 새 튜브에 피펫팅하고 비오틴 키네신을 10나노 어금니에 첨가한 다음 배양 후 스트렙타비딘 완충액과 혼합하여 키네신 용액을 준비합니다. 15마이크로리터의 BSA 버퍼로 각 레인을 세 번 헹굽니다.그런 다음 15마이크로리터의 알파 kcn 완충액으로 각 레인을 헹구어 kinesin 및 미세소관이 유리에 비특이적으로 결합하는 것을 줄입니다. 다음으로, 각 레인에 15마이크로리터의 키네신 용액을 추가하고 15분에서 1시간 동안 배양합니다. 이 기간 동안 비오틴 키네신은 표면 결합 스트렙타비딘과 강력한 결합을 형성하고 키네신 운동 영역이 미세소관 결합을 위해 접근할 수 있도록 합니다.그 동안 40 마이크로 몰 파클리탁셀과 알파 KC 및 완충액의 용액을 준비합니다. 파클리탁셀(Paclitaxel)은 미세소관의 해중합을 방지하는 데 중요합니다. 흄 후드에서 95 마이크로 리터의 알파 KCM 완충액, 2.5 마이크로 리터의 포도당 저장액, 1 마이크로 리터의 100 x 산소 소거를 함께 혼합하여 형광 표백 방지 완충액을 준비합니다.1마이크로리터의 파클리탁셀과 DMSO를 4밀리몰로 혼합합니다. 그리고 마지막으로 1마이크로리터의 베타 미 캡토 에탄올입니다. 배양 후에는 15마이크로리터의 실온으로 각 레인을 세척하여 유리 비오틴 키네신을 헹굽니다.콜드 버퍼를 사용하는 알파 키안 용액의 파클리탁셀은 미세소관을 해중합할 수 있습니다. 마지막으로, 형광 표백제 방지 완충액을 새 튜브에 파이프로 연결하고 형광 표지된 미세소관을 1-100:1:1000의 희석액에 추가합니다. 그런 다음 1 밀리 몰 TP를 넣고 섞습니다.15마이크로리터의 미세소관 용액을 한 레인에 주입하고 30분 이내에 형광 현미경을 사용하여 관찰합니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 미세소관이 겹치지 않도록 하고 낮은 배경을 갖도록 미세소관을 최적으로 농도 조절하는 것입니다. 나머지 레인은 미세소관 농도를 최적화하는 데 사용되며, 현미경 자체를 사용하여 정렬하고 초점을 맞춥니다.활공 미세소관의 이미징은 집에서 만든 전반사 형광 현미경을 사용하여 수행됩니다. 100 x 높은 개구수 대물렌즈는 약 50미크론 x 50미크론의 자기장을 표시하며, 이는 초당 0.5미크론 세트의 속도로 약 100초 동안 움직임을 볼 수 있는 충분한 공간입니다. 3-5 밀리 와트의 전력 설정으로 여기하는 데 사용되는 레이저.이 전력은 적절한 이미징 시간을 허용하기 위해 100초 이상 빠르게 4층 바닥의 광표백을 방지할 수 있을 만큼 충분히 낮습니다. 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 2분 동안 초당 5프레임의 이미지 시퀀스를 수집합니다. 염기서열은 미세소관이 전체 시야를 횡단할 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다.파일과 같은 IDL 루틴을 사용하여 이미지 데이터를 분석하고 보충 자료에서 얻을 수 있는 LP Pro를 가져옵니다. 이 DL 루틴은 주어진 이미지 시퀀스에서 미끄러지는 모든 미세소관을 기반으로 하는 지속성 길이 값을 반환합니다. fluoro four intensity 및 microscope setup에 따라 intensity 매개변수를 수정합니다.여기에 표시된 것은 전반사 형광 현미경으로 촬영한 글라이딩 분석법입니다. Fluor fours는 미세소관의 길이를 따라 드문드문 장식된 것을 볼 수 있습니다. 방금 표시된 단일 Fluoro 4 궤적이 병합되어 평균 10 Fluor 4를 100 나노미터당 단일 지점으로 결합하여 데이터 분석을 개선합니다.단일 미세소관을 볼 때 각 점 사이의 접선각을 쉽게 계산하고 길이의 함수로 매핑할 수 있습니다. 접선 각도를 사용하여 지속성 길이를 계산할 수 있으며 여기에 표시된 방정식을 사용하여 세그먼트 길이당 평균 cosign을 표시할 수 있습니다. 가장 잘 맞는 라인은 일단 마스터하면 결정할 수 있습니다.이 기법은 적절하게 수행된다면 3-4시간 내에 수십 개의 미세소관의 굽힘 강성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

사용 중인 폴리머 및 섬유 강화 폴리머 복합재의 내구성은 설계 및 상태 기반 유지 관리에 중요한 측면입니다. 우리는 동시 기계 및 환경 부하의 영향을 조사하기 위한 새로운 저비용 실험실 테스트 플랫폼을 제시하고 보다 효율적이면서도 안전한 복합 구조를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.

폴리머의 내구성 연구 및 동시 Hygrothermo 기계적 자극에 따라 섬유 강화 고분자 복합 재료에 대한 테스트 플랫폼

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

신규 방법론은 합성 및 프로그램 주쇄 액정 엘라스토머 시판 출발 단량체를 사용하기 위해 제시된다. 작동 성능은 프로그래밍 동안인가 변형량에 의존하면서 열 기계적 특성은 넓은 범위, 가교제의 양을 조절하여 맞춤되었다.

이단 티올 레이트 반응을 이용하여 프로그래밍 주쇄 액정 엘라스토머의 합성

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

우리는 주문 품 기계 테스트 장치를 사용 하 여 하위 밀리미터 규모 섬유에 3 포인트 벤딩 테스트를 수행 하기 위한 프로토콜을 제시. 소자 최대 10 N 20 µN에서 배열 하는 힘을 측정할 수 있으며 따라서 다양 한 섬유 크기를 수용할 수 있습니다.

밀리미터 규모 굴곡 테스트 시스템 해양 스폰지 Spicules의 기계적 특성을 측정 하기 위한

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

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새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.

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여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

복잡한 매트릭스에서 더 민감한, 재현성, 자동 검색 결과에 대한 바이브 플랫폼에서 사용자 정의 assays의 개발을 설명합니다. 유니버설 카트리지는 assays 쉽게 사용자 정의 assays 사용하기 위해 적응 수 있습니다. 이 다재 다능한이 소설 assays 본 동영상에 exemplified 기존의 수동 assays의 자동 버전의 신속한 개발 및 검증이 가능합니다.

어쿠스틱 막 Microparticle 기술을 사용하여 개발 사용자 지정 중국어 햄스터 난소 - 숙주 세포의 단백질 Assays

배우세요 키네신 구동 글라이딩 분석법을 사용하여 미세소관의 굽힘 강성을 측정하는 방법을. 형광 현미경으로 개별 미세소관의 지속 길이를 실험적으로 결정하고 세포골격 역학을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

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