Name: Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer enkele neuronen labelen in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster embryo's met lipofiele kleurstoffen. Deze methode maakt gedetailleerde morfologische analyse via confocale microscopie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de DFG naar GMT

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin. (1985).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een groot voordeel van Drosophila als model is dat het onderzoek van de ontwikkeling en functie van het niveau van afzonderlijke cellen mogelijk maakt. Dit is vooral handig over het zenuwstelsel, waar de diversiteit van celtypen uitzonderlijk hoog en de werking en vorm van naburige cellen kan heel anders. De werkwijze die we hier kunnen de kenmerken van individuele neuronen met een kleurstof die kan worden omgezet in een permanente vlek of rechtstreeks onderzocht door fluorescentie ...

Kennis van neuronale morfologie op het niveau van individuele cellen is een belangrijke voorwaarde voor het begrijpen van neuronale connectiviteit en CZS-functie. Zo vanaf de vroegste dagen van de neurowetenschappen, hebben onderzoekers getracht enkele cel etikettering technieken (zie 7 voor een historische behandeling van deze kwestie) te ontwikkelen. Klassieke methoden, zoals Golgi kleuring geven uitstekende resolutie van neuronale morfologie maar zijn niet geschikt als men streeft naar een bepaald type neuron label in het gericht, zoals kleuring optreedt op een willekeurige manier. De ontwikkeling van methoden voor het beitsen van enkele cellen door intracellulaire of juxtacellular injectie van kleurstoffen uit een micro-elektrode in op de eis van specifieke etikettering. De toepassing van enkelvoudige neuron kleurstof injectie Drosophila een belangrijke uitdaging, vanwege de kleine afmetingen van zowel het organisme en de neuronen. Niettemin enkel neuron kleuring van embryonale Drosophila </em&gt; Neuronen werd bereikt in het midden van de jaren 1980 in het laboratorium van Corey Goodman 15. Terwijl de methode is bij uitstek nuttig en heeft een aantal belangrijke inzichten in de mechanismen voor neuronale ontwikkeling in Drosophila in de afgelopen 20-30 jaar (bv 2, 10), hebben veel werknemers teruggeschrokken van het, grotendeels als gevolg van de technische eisen. De beschikbaarheid in meer recente jaren van genetische technieken voor neuronale etikettering in Drosophila heeft ook bijgedragen aan de impopulariteit van enkel neuron kleurstof injectie. GAL4-gerichte expressie van membraan gerichte GFP constructen kunnen uitstekende resolutie van neurale morfologie 1, 20. Deze methode heeft bepaalde beperkingen: de vaak onvermijdelijk expressie van GFP in meerdere cellen kan de structuur van individuele neuronen verhullen en een GAL4 rijders niet beschikbaar voor expressie in een bepaald neuron plaats. De MARCM (Mosaic Analyse met een Repressible Cell Marker) methode 8 kan coderen van in wezen elke neuron op individueel celniveau, maar niet met succes worden gebruikt in de embryo en vroege larve vanwege de lage omzet van de GAL80 eiwit. Gezien deze beperkingen van genetische kenmerken wij dat enkel neuron kleurstof injectie in de Drosophila embryo een waardevol techniek en verdient bredere toepassing. Om dit doel te bevorderen, wij hier een gedetailleerde beschrijving van de werkwijze. Een illustratie van het vermogen geleverd door onze recente houden met de morfologie van de benodigde interneuronen in abdominale neuromeres de late Drosophila embryo 14. Deze studie, die zowel de morfologische variabiliteit van individuele neuronale celtypen en de beginselen van neuromere organisatie in het CZS van de embryo geopenbaard, zou niet mogelijk zijn geweest met andere momenteel beschikbare labelingsmethode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTIA </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml in ethanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehyde</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% in PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glycerol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% in PBS </td></tr><tr><td> Heptaan Lijm </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> verdunnen ca. 1-1 met n-Heptane </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> APPARATUUR </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> te bekijken en te labelings documenteren in fluorescentie </td></tr><tr><td> DC - eenmplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> het voeren labelings </td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> voor te bereiden en disect embryo&#39;s </td></tr><tr><td> Flat Haarvaten </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> buitendiameter 1 mm, dikte 0,1 mm glas </td></tr><tr><td> Injectie Haarvaten </td><td> Science Products </td><td> GB 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator R </td><td> Leica </td><td></td><td> het voeren labelings </td></tr><tr><td> Model P-97 </td><td> Sutter Instrumenten </td><td></td><td> om haarvaten te trekken </td></tr><tr><td> Object Slides </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Wetenschappelijke Microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> om labelings bekijken nadat fotoconversie </td></tr><tr><td> Wetenschappelijke Microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td> het voeren labelings </td></tr><tr><td> Sony MC3255 Video Camera </td><td> Sony / AVT Hoorn </td><td> Sony MC3255 </td><td> om labelings na fotoconversie opnemen </td></tr></tbody></table> Tabel 1.

labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In dit artikel beschrijven we hoe u individueel neuronen in de embryonale CZS van Drosophila melanogaster door juxtacellular injectie van de lipofiele fluorescente membraan merker Dil labelen. Deze methode maakt het mogelijk de visualisatie van de neuronale celmorfologie in groot detail. Het is mogelijk om een ​​cel label in het CZS: cellichamen van neuronen doelwit zichtbaar gemaakt onder DIC optiek of door expressie van een fluorescente genetische merker zoals GFP. Na etikettering, de Dil worden omgezet in een permanente bruine vlek door fotoconversie tot visualisatie van celmorfologie toe met doorvallend licht en DIC optiek. Als alternatief kan de DiI gemerkte cellen direct worden waargenomen met confocale microscopie, waardoor genetisch geïntroduceerd fluorescerende reporter eiwitten worden colocalised. De techniek kan worden gebruikt in een dier, ongeacht het genotype, waardoor het mogelijk mutant fenotype analyseren cel resolutie.

Figuur 4 toont typische resultaten van de techniek, de hier beschreven. Figuur 4A toont een voorbeeld van een gevulde DiI enkele interneuron dat zuiver was photoconverted. Het toont mooi de mate van detail deze voorbereidingen aanbod. Wanneer bekeken onder DIC optiek de ruimtelijke context van de gemerkte cel in de niet-gemerkte omringende weefsel zichtbaar wordt, bijvoorbeeld de positie van het cellichaam in de cortex en de vezels in de projectie neuropile. <p class="jove_...

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS) van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s die de analyse van neuronale morfologie door een doorvallend licht of confocale microscopie mogelijk.

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel van 17-daagse drosophila-embryo's in het vroege stadium te labelen. Dit wordt bereikt door eieren te verzamelen en ze zich te laten ontwikkelen tot de juiste fase. De tweede stap van de procedure is het handmatig chloorineren en uitlijnen van de eieren.Na deze diva worden de embryo's gekoloniseerd en gefilet om de zenuwsnoer toegankelijk te maken. De laatste stap is het labelen van enkele cellen door middel van ionoretische toepassing van de lipofiele die die oog. Uiteindelijk bieden de resultaten de mogelijkheid om de morfologie van een enkel neuron te visualiseren indien gewenst in de context van bekende GFP-expressiepatronen en/of in een mutante achtergrond.Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden voor het labelen van enkele cellen, zoals markum, is dat het in het embryo werkt en het mogelijk maakt om geïdentificeerde cellen opzettelijk te visualiseren. Visuele demonstratie van deze methode is uiterst nuttig omdat veel stappen delicaat zijn en daarom moeilijk te leren. Laat gezonde vliegen embryo's op agarplaten leggen.Vervang de plaat elke anderhalf uur bij 25 graden Celsius en bewaar de embryo's. Incubeer de embryo's op hun platen bij 25 of 18 graden Celsius tot ze de vereiste ontwikkelingsfase bereiken. Wanneer ze klaar zijn, breng je de embryo's over naar een schuifje bedekt met dubbelzijdig plakband.Vermijd het overbrengen van agar met de embryo's, omdat dit hun hechting aan het plakband zal verstoren. Laat de embryo's vijf tot 10 minuten drogen terwijl u wacht.Bedek een dekglas van 24 millimeter bij 60 millimeter met heptaanlijm. Plaats een kleine druppel lijm in het midden van de schuif en spreid deze uit tot een zeer dunne film met behulp van een dekglas van 18 millimeter in het vierkant. Zodra de embryo's zijn opgedroogd, raak ze voorzichtig aan met een naald.Het corion zal opensplitsen en het embryo zal aan de naald blijven plakken. Breng de gechlorineerde embryo's onmiddellijk over naar een agarblok om te voorkomen dat ze uitdrogen. Lijn ze daar 10 op een rij uit, met de ventrale kanten omhoog.Snijd het overtollige agar van het blok weg met een scalpel. Raak vervolgens de embryo's voorzichtig aan met het met heptaanlijm beklede dekglas. Ze moeten met hun ventrale kanten naar beneden aan het dekglas hechten.Breng een rand van plakband rond het dekglas aan en bevestig het aan een microscoopplaatje. Houd de embryo's bovenop het dekglas. Bedek de embryo's met royaal bedrag van PBS aan de dorsale zijde van elk embryo in de buurt van het achterste uiteinde.Doorboor het vitelmembraan met een glazen naald, scheurt het membraan open langs de dorsale middenlijn en trekt het embryo uit het membraan. Orienteer het embryo vervolgens op een andere plaats op het heptaanlijm substraat met de ventrale zijde naar beneden. File het embryo met een glazen naald door de lichaamswand voorzichtig te doorboren en langs de dorsale middenlijn te scheuren.Gebruik de naald om op de lichaamswand te drukken zodat het aan de schuif blijft plakken. Scheurt door het darmkanaal bij het voorste en achterste uiteinde en tilt het darmkanaal op. Aangezien er meerdere embryo's op dezelfde schuif worden gefilet, is het nuttig om of zeer nauwkeurig te zijn met hun oriëntatie of een tekening van hun oriëntatie te maken.Vervolgens kunnen de embryo's lichtjes worden gefixeerd gedurende 10 tot 15 minuten in 7,4% formaldehyde in PBS, gevolgd door vier wasbeurten in PBS. Gebruik extreme voorzichtigheid om te voorkomen dat de embryo's raken aan het oppervlak van de oplossing. De oppervlaktespanningskrachten zullen ze onder een 10 x objectief vernietigen. Centreer het veld van zicht op een voorbereid embryo, verhoog de vergroting en lokaliseer de cel van belang onder DIC-optiek of onder fluorescentie.Als de doelcel GFP tot expressie brengt, zorg er dan voor dat het velddiafragma van de microscoop net tot aan de rand van het veld van zicht wordt geopend, maar niet verder dan een smalle verlichting. Een straal zal helpen bij het positioneren van de micropipet. Ga terug naar het 10 x objectief en plaats de badelektrode voor de DC-versterker in de oplossing ver weg van het embryo en de weg van de micropipet. Monteer de injectiemicropipet gevuld met lithiumchlorideoplossing op de houder en bevestig deze aan de micro manipulator.Gebruik de grove bediening om de micropipet onder het objectief en ver boven het embryo te positioneren. Als de hoek van de micro pipet te steil is, komt de punt niet scherp. Als het te ondiep is, raakt de schacht tegen de badwand. Centreer de punt in het veld van zicht.Laat nu de micropipet zakken en focus afwisselend totdat de pipet in de PBS is en niet te ver boven het embryo. Verander nu naar een objectief met hoge vergroting en centreer de pipet binnen het veld van zicht. Wanneer de schacht scherp is, beweeg de micropipet in de X-as tot de punt in het midden van het veld van zicht ligt.De punt van de micropipet moet ver boven het niveau van het embryo zijn. Schakel over naar fluorescentiebelichting en onderzoek de punt. Controleer op lekkage van kleurstof.Stel de DC-stroom zo in dat er geen kleurstofkristallen op de punt worden opgebouwd. Laat nu de micro pipet in de Z-as naar het embryo zakken. Pas geleidelijk de focus aan terwijl het embryo scherp komt.Schakel over naar het gebruik van de fijne regeling. Focus de cel die moet worden geïnjecteerd in het midden van het veld en focus vervolgens opnieuw op de punt van de micropipet. Vanaf dit punt is het misschien handiger om de trap van de microscoop te gebruiken om het embryo ten opzichte van de micropipet te verplaatsen.Breng de punt van de micropipet in contact met de cel en maak een kuiltje op het oppervlak. Laat enkele nano ampère depolariserende stroom door voor een paar seconden. Er zal een klein kristal van kleurst

labeling-single-cells-central-nervous-system-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel zullen we laten zien hoe het centrale zenuwstelsel ontleden uit derde instar Drosophila larven.

Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en...

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

This video demonstrates the immunofluorescence staining of a transgenic Drosophila brain for single-cell imaging of glial cells. The brain expresses membrane-targeted proteins fused with different combinations of antigenic epitopes under the control of a glial-specific recombinase system. The isolated and fixed brains are stained with primary antibodies specific to the antigenic epitopes, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. This labeling enables the simultaneous imaging of...

Immunofluorescence Staining of Drosophila Brains for the Single-Cell Imaging of Glial Cells

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.

Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer enkele neuronen labelen in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster embryo's met lipofiele kleurstoffen. Deze methode maakt gedetailleerde morfologische analyse via confocale microscopie mogelijk.

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van

Meer video's verkennen