使用して樹状細胞の移行の監視

本実験の全体的な目的は、非侵襲的なフッ素磁気共鳴画像法（MRI）と従来のプロトンMRIを組み合わせて、排出リンパ節への樹状細胞の遊走を可視化することです。まず、マウス骨髄由来樹状細胞を調製し、完全に分化した細胞をフッ素含有粒子で標識します。次に、フッ素標識した細胞をマウスの後肢に皮内投与し、投与した細胞の効率的な移行を確保します。

次に、皮膚から排出リンパ節への樹状細胞の移行をモニタリングするために、フッ素およびプロトンMRIを用いて目的の解剖学的領域を撮影します。最終的に、投与部位から排出リンパ節への樹状細胞の移行をフッ素MRIで視覚化することが可能です。酸化鉄ナノ粒子を必要とする手法などの他の細胞追跡技術に対する本手法の主な利点は、炭素結合フッ素がすべての生物において実質的に存在しないことです。

これにより、in vivoでフッ素標識細胞を投与した後、背景ノイズが完全に排除された画像と完全な細胞選択性が得られます。この手法は、in vivoにおける樹状細胞の遊走に分子候補がどのような影響を及ぼすかなど、免疫学分野における疑問の解決に役立ちます。本手法の実演は、骨髄由来樹状細胞培養の10日目に、技術者のYulia Kovskiと私の研究室のシニアサイエンティストであるHelma VIIsが行います。

LPSを用いて樹状細胞を24時間活性化させます。この間に、1 mMのフッ素富裕パーフルオロ15-クラウン-5エーテル粒子で樹状細胞をラベルします。樹状細胞が正常にラベルされたことを確認するため、フローサイトメトリーを用いて細胞の物理化学的特性をチェックします。フッ素ラベルされた細胞は、前方散乱光および側方散乱光プロットにおいて赤色のイベントとして示され、未ラベルの細胞は青色のイベントとして示されています。

次に、C 57black/6マウスをホルダーに固定し、26.5ゲージの針を装着した0.5 mL用ツベルクリン注射器に、50〜100 µLの蛍光標識樹状細胞を充填します。次に、細胞を投与するため、動物の両後肢の皮膚上層に慎重に針を刺入します。マウスを麻酔後、小型動物用MRスキャナーのマウスベッド上に腹臥位で配置します。

動物をイメージングホルダーに固定し、モニタリングシステムへの接続を完了させた後、動物とスキャナーが正しく配置されているかを確認し、後の画像スライス形状の計画を立てるため、ホルダーをプロトン・フッ素RFコイルの中心に移動させます。MRスキャナーのソフトウェアを用い、高速かつ低解像度の画像取得法を使用して、3つの標準的な方向でスカウト画像を取得します。

RFコイルをプロトンの共鳴周波数およびフッ素の共鳴周波数に調整します。動物用MRスキャナーのチューニングモニターを使用して、コイルの特性インピーダンスを50 ohmsに合わせます。次に、磁場システムの均一性を微調整するためのシミング、プロトンおよび参照ゲインに対するMRシステムの特定のLA周波数にRFを合わせるためのシステム周波数調整など、必要な自動システム設定を行います。

RF振幅を調整するため、TR 1500 milliseconds、TE 53 milliseconds、マトリックス 400 × 200 × 200、RARE係数 16に設定し、プロトン・スキャンのためのturbo rare 3Dプロトコルをセットアップします。スカウト画像を用いて視野（FOV）を調整してください。その後、スキャンを開始します。

TRを1000 milliseconds以上に設定したシングルパルスFIDシーケンスをロードし、ツールボックスの編集メソッドで「edit scan」を開き、核種をフッ素に設定します。「go setup」を使用して、自動リファレンスゲインの選択を解除してください。データを記録せずに測定を開始し、MR信号をリアルタイムで表示させます。

基本周波数を調整し、収集ウィンドウ内の0 Hzにフッ素のスペクトルピークを中心させます。次に、[select]、[apply basic frequency]を選択し、[stop now]を押します。前のプロトン・スキャンのturbo rare 3Dプロトコルを複製します。

「編集メソッド」に移動し、「編集スキャン」で示したように、自動リファレンスゲインの選択を解除します。フッ素原子核を設定し、マトリックスを 1 28 × 64 × 64 に、レアファクターを少なくとも 40 に変更します。スキャンが完了したら、MRスキャナーからマウスホルダーを後退させ、「ビュー」メニューを使用してフッ素画像をプロトン画像に重ね合わせます。

マウスを安楽死させた後、目的の膝窩リンパ節を取り出し、100 µLの2% PFAが入った5 mmのNMRチューブに入れます。次に、チューブをフッ素分光コイル内に設置し、コイルを磁石のISOセンターまで移動させます。RFコイルをフッ素の共鳴周波数に調整し、動物用MRスキャナーのチューニングモニター上で、シミングツールボックスを使用してコイルの特性インピーダンスを50 ohmsに合わせます。

すべてのシムパラメータをゼロに設定し、「適用（apply）」を押します。次に、TRが1000 milliseconds以上のシングルパルスFIDシーケンスをロードします。「スキャン編集（edit scan）」を開き、核種をフッ素に設定します。

次にgo setupを使用し、シーケンスを開始します。フッ素のスペクトルピークが、0 Hzで収集ウィンドウの中心に来るように基本周波数を調整し、その基本周波数を適用します。その後、90度の励起に達し信号が最大となるよう、パルスアッテネーターを再度調整します。信号が最大になったら、stopを押してください。

最後に、編集メソッドで、信号に応じて平均回数を64から256の間に設定し、「go pipeline」を使用します。皮内投与から18〜21時間後に撮像を開始します。フッ素標識された樹状細胞が、ドレナージされる膝窩リンパ節へと遊走します。

樹状細胞がリンパ管を通って排出区域の鼠径リンパ節へ移動する様子は、プロトンの解剖学的画像にフッ素標識樹状細胞の画像を重ね合わせることで確認できます。画像では、樹状細胞はフッ素MRシグナルとして赤色で示され、リンパ節とリンパ管はプロトン解剖学的MR画像でグレースケールに示されています。排出リンパ節への樹状細胞の遊走範囲を定量化するため、リンパ節を抽出して、先に示した方法でフッ素MRSを実施します。各リンパ節から得られたフッ素シグナルを、この検量線に示されるように、perfluoro 15-crown-5 ether粒子で標識された異なる数の樹状細胞から得られたフッ素シグナルと比較することで、この代表的な実験において排出リンパ節に到達したフッ素標識樹状細胞の数を推定できます。

抗原を負荷していない樹状細胞が7.5 × 10⁴個が左リンパ節に到達した一方で、抗原を負荷した樹状細胞は3.6 × 10⁵個が右リンパ節に到達したと推定されます。この知見は、通常条件下における免疫細胞移動の分子メカニズムへの洞察を与えるだけでなく、自己免疫疾患などの動物モデルにも応用可能です。さらに、本手法の意義はがん治療の分野にまで及びます。

特定されたあらゆる分子標的を、腫瘍治療のために樹状細胞を操作する目的で使用することができます。