היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים
22 ביוני 2013
כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.
המטרה הכללית של נוהל זה היא לבודד מזנכימה של הסינוס העורוגניטלי (UGSM) מעוברי מכרסמים ולהשתיל תערובות רקמה לתוך הקפסולה הכליתית (renal capsule) שיוכלו ליצור אפיתליום של ערמונית אנושית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד הסינוס העורוגניטלי מעוברי עכבר או חולדה. לאחר מכן, המזנכימה של הסינוס העורוגניטלי מופרדת מהאפיתליום.
לאחר מכן, תרחיפי תאים בודדים של מזנכימה מהסינוס העורוגניטלי משולבים עם תאי גזע פלוריפוטנטיים. לבסוף, תערובת התאים מושתלה תחת הקפסולה הכלית של עכבר מאכיל. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות היווצרות של אפיתל פרוסטה אנושי על הכליה של העכבר, באמצעות תיקוף של ביטוי PSA ספציפי לאדם.
אף ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד הערמונית ותחילת מחלה, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון השתקת גידולים של ערמונית אנושית (xenograft) והשראה של תאי קו תומגניים שבועיים ליצירת גידולים. לאחר המתילת עכברה או חולדה בהריון מתוזמן ובידוד העוברים, הפרידו אותם משקית השתן, חסכו את חבל הטבור והעבירו אותם לשפופרת 50 milliliter המכילה hanks balance salt solution קר מאוד, ושמרו על קרח.
הניחו עובר בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר והשתמשו במספריים כדי לחצות אותו בגובה הבולוס. הסירו את הקיבה ואת המעי הדק, ולאחר מכן אתרו בעובר נקבה את השחלות, הנמצאות בקטבים העליונים של הכליות, או בעובר זכר את האשכים הנמצאים בגובה של שלפוחית השתן. בצעו זאת תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
השתמשו במספרי Venice כדי לחתוך את דופן הבטן כדי לחשוף את השלפוחית ואת הדופן האחורית של הבטן. שחררו את דרכי הרבייה העליונות מההיבטחים ושחררו את חבל הששריק. חתכו את עצם הפוביס בעזרת פינצטה Dumont בעלת קצה דק.
הפרידו זאת בעזרת דיסקציה קהה מהדופן הקדמית של הסינוס העורוגניטלי. הפרידו את הדופן האחורית של הסינוס העורוגניטלי מהרקטום וחתכו את הסינוס העורוגניטלי יחד עם שלפוחית השתן בקצה התחתון. לאחר מכן, הפרידו את שלפוחית השתן מהסינוס העורוגניטלי.
אחסן את הסינוס העורגניטלי (urogenital sinus) ואת הבלוק ב-HBSS קר בקרח. העבר את הסינוס העורגניטלי למבחנה של 50 מיליליטר המכילה 1% trypsin ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום, והדגר בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, הסר את ה-trypsin והוסף 10% FBS ומצע DMA MF 12 כדי לנטרל את העיכול.
בשלב הבא, השתמשו במחט או בפינצטה בעלת קצה דק כדי להפריד בעדינות את המעטפת המזנכימלית הדביקה מהצינור האפיתליאלי. שמירה על שלמות הצינור האפיתליאלי מפחיתה את הסיכויים לזיהום של המזנכימה בתאים אפיתליאליים. הדבר עלול להוביל להיווצרות בלוטות של מכרסמים יחד עם האפיתל הגלנדולרי האנושי המופק מתאי גזע.
העבירו את ה-UGSM למבחנה חדשה בנפח 50 מיליליטר המכילה מצע DMM F 12 עם 10%FBS, 1%pen strep, 1%non-essential amino acids ו-one nanomolar R 1 8 81. דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C עם 5%CO2 למשך לילה. למחרת, סובבו את הרקמה בצנטריפוגה ב-200 G. השליכו את העליון (supernatant) והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את המשקע.
לאחר הסרת ה-PBS, השביחו מחדש את הרקמה ב-0.2% Collagenase בתוך D-M-A-M-F 12 והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C תוך써 נטילת עדינה למשך שעה אחת. ערבבו בעוצמה ב-vortex את הרקמה שעברה עיכול שלוש פעמים עד להשגת תערובת הומוגנית של תאים בודדים, ונטרלו את ה-collagenase על ידי הוספת מצע D-M-A-M-F 12 עם 10% FBS, 1% pen strep, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1 nanomolar R 1 8 81. שטפו את התאים שלוש פעמים על ידי שקיעה ב-200 G והשביחה מחדש ב-HBSS. לבסוף, השביחו מחדש את התאים המזנכימליים ב-DMM F 12 והשתמשו ב-hemocytometer כדי לספור אותם לצורך ביצוע השתלתם.
לאחר הכנת אזור ניתוחי סטרילי והרדמה של עכבר זכר עירום אתמי (athymic nude) באמצעות הזרקה IP של ketamine xylazine, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו צביטה של בהו כדי לאשר את רמת הסדציה; הכינו את העכבר לניתוח על ידי גילוח אתר הניתוח במידת הצורך, וניקויו בשלוש הגעות לסירוגין של 70% alcohol ולאחריהן תמיסת Betadine. לאחר מריחת משחה לעיניים, בצעו חתך אlongitudinal של סנטימטר אחד בגב והמשיכו לחתוך את דופן הבטן בחתך longitudinal של 0.5 סנטימטר. הוציאו בעדינות את הכליה מהבטן והשתמשו בטיפות של saline סטרילי כדי לשמור על לחותה.
בשלב הבא, באמצעות מחט מזריקה בכישור 27, נקבו בעדינות את קפסולת הכליה כדי ליצור אתר הזרקה עבור תערובת התאים. לאחר מכן, מלאו מחט מזריקה בכישור 28 ב-10 µL של תערובת התאים והחדירו אותה באיטיות לאתר הדקירה, תוך חדירה לפארנכימה של הכליה, כדי להגיע לאזור הנמצא מתחת לקפסולת הכליה.
הזריקו 10 µL של התערובת התאית ליצירת בולוס בכליה, מתחת לקפסולה הרנלית, והוציאו את המחט. החזירו את הכליה לחלל הבטן והדביקו את השכבה השרירית של הפריטונאום באמצעות ארבע תפרים של ניילון במידה 0. סגרו את העור באמצעות תפרים או סיכות, והשתמשו בתמיסת סלין סטרילית כדי לנקות דם מהעור.
כאן מוצגת תמונת אולטרסאונד של קסנוגרפט (xenograft) גדל שמונה שבועות לאחר ההשתלה. האזור המוקף במעגל מייצג את הקסנוגרפט על פני הכליה. תמונות אלה מדגימות צמיחה של קסנוגרפט על פני הכליה.
לאחר 12 שבועות, תאי ES אנושיים שהושתלו ללא סינוס אורוגניטלי, מזכימה תייצר טרטומות גדולות, בעוד שמזכימה של סינוס אורוגניטלי שהושתלה לבדה לא תצליח ליצור כל מבנה שניתן לזיהוי. מוצג במרכז. פאנלים של דמות זו הם צביעות אימונוהיסטוכימיות מייצגות של אפיתל פרוסטטה אנושי שנגזר מתאי גזע לעומת רקמת פרוסטטה אנושית בוגרת.
כפי שמוצג כאן משמאל, בלוטות אלו מכילות שכבת אפיתל לומינלי חיובית ל-AR. שכבה זו חיובית גם ל-PSA, לצד שכבת תאי אפיתל בסיסליים חיוביתית ל-P 63 ותאים נורואנדוקריניים נדירים חיוביים ל-chromogranin A. הבלוטות אינן סרטניות, כפי שעולה מצביעת A-M-A-C-R שלילית לאחר סירוס של המארח.
התאים הלומינליים החיוביים ל-AR PSA אינם נוכחים יותר, מה שמעיד על תלות אנדרוגנית אופיינית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בהפרדת המזנכימה של הסינוס העוגניטלי (urogenital sinus) מהאפיתל. זאת מכיוון שאפיתל מזוהם של הסינוס העוגניטלי יגרום להיווצרות בלוטות ועלול להטעות את התוצאות שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבידוד מזנכימה של הסינוס העורוגניטלי (UGSM) ממכרסמים על מנת לבחון את פוטנציאלה ביצירת אפיתליום של ערמונית אנושית. באמצעות שילוב של UGSM עם תאי גזע פלוריפוטנטיים והשתלת התערובת בקפסולה הכלית של עכבר מאכסן, חוקרים שואפים להבין את מנגנוני ההיווצרות של סרטן הערמונית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר על סרטן הערמונית
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- סרטן הערמונית הוא בעיה בריאותית משמעותית.
- הבנת המנגנונים המולקולריים המוקדמים היא קריטית למניעה.
- דרושות מערכות מודל אנושיות לצורך מחקר יעיל.
- ל-UGSM יש פוטנציאל ביצירת אפיתל של הערמונית.
מטרת המחקר
- לבידוד UGSM מעוברי מכרסמים.
- לבדיקת היכולת של UGSM להשרות התפתחות של אפיתל פרוסטטה אנושי.
- לפיתוח מודל לחקר תחילתו של סרטן הערמומי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של הסינוס העורוגניטלי מעוברי מכרסמים.
- הפרדת ה-UGSM מהאפיתל.
- שילוב של UGSM עם תאי גזע פלוריפוטנטיים.
- השתלה של תערובת התאים תחת הקפסולה הרנלית (קפסולת הכליה) של עכבר מאכיל.
תוצאים עיקריים
- היווצרות מוצלחת של אפיתל ערמונית אנושי על כליה של עכבר.
- תיקוף באמצעות ביטוי של PSA הספציפי לבני אדם.
- הדגמה של הפוטנציאל של UGSM במחקר של הערמונית.
- תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של התחלה של סרטן הערמונית.
מסקנות
- UGSM יכול להשרות ביעילות היווצרות של אפיתל ערמונית אנושי.
- מודל זה מהווה כלי בעל ערך למחקר של סרטן הערמונית.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון את המנגנונים העומדים בבסיס התהליך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לצורך הקריטי במערכות מודל ממקור אנושי שאינן חשופות להורמונים (hormone-naïve) במחקר של סרטן הערמונית, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של גורמי פגיעוּת גנטית. באמצעות ניצול מזנכימה של הסינוס העורוגניטלי של מכרסמים כדי להשרות אפיתל של ערמונית אנושית מתאי גזע, היא מספקת פלטפורמה חזויה לתיקוף מטרות ולחקירת מסלולים. גישה זו תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי האצת הבדיקות הפונקציונליות של גנים מועמדים לקרינוגנזה לפני זיהוי המולקולות המובילות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות בחינת ההשלכות הפונקציונליות של גנים מועמדים לרגישות לסרטןה פרוסטטה בהקשר של אפיתל אנושי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות יצירה תלויה בטסטוסטרון של אפיתל פרוסטטה אנושי תקין, תוך הבהרת תלות באותות קולטן אנדרוגן.
- ערך ניבוי: מאיץ את הערכתם של שילובי גנים הנחשבים ככאלה המקדמים או מונעים קרצינוגנזה בהשוואה למודלים טרנסגניים מסורתיים של מכרסמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות לבדיקה: יוצר מבנים אפיתליאליים של פרוסטטה אנושית שעברו תיקוף, המתאימים לסריקת תרכובות להמשך וניתוח סממנים ביולוגיים.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של ביטוי PSA ספציפי לאדם כמדד תפקודי להבדלה אפיתליאלית ולתגובה לאנדרוגנים.
- שחזוריות: בידוד סטנדרטי של UGSM והשתלה בקפסולה הכלית תומכים בעקביות בין מעבדות ביצירת המודל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: יוצר אפיתליום של ערמונית אנושית שאינו חשוף להורמונים, אשר משחזר את השושלות הבזאליות והלומינליות, ובכך מאפשר לחקור אירועים מוקדמים של קרצינוגנזה.
- המשכיות תרגומית: מספק גשר ממניפולציה גנטית של תאי גזע לתוצאות פנוטיפיות ברמת הרקמה במארח עם מערכת חיסונית מוחלשת.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר הערכה של שינויים גנטיים תחת תנאים מבוקרים התלויים באנדרוגן לפני התחייבות לתוכניות פרה-קליניות יקרות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות לגבי גורמים גנטיים במערכת אפיתליאלית רלוונטית לבני אדם, ובכך תומכת בקבלת החלטות של go/no-go לפני פיתוח בדיקות ומאמצים לזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבירור נתיבים ובהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנים כגון אינטראקציות סטרומליות-אפיתליאליות בהיווצרות רקמת ערמונית.
- סריקה: מייצרת מבנים אפיתליאליים סטנדרטיים שניתן להשתמש בהם להערכת השפעות של תרכובות על דיפרנציאציה ותגובה הורמונלית.
- אנליזה: מייצרת סממנים ביולוגיים כמותיים הספציפיים לבני אדם (למשל, PSA) ותוצרי קריאה אימונוהיסטוכימיים לאימות שושלת תאים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברצף מהפרעה גנטית לתוצאות היסטולוגיות במערכת הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקת מטרות גנטיות מרובות או שילובים שלהן במודל עקבי של אפיתליום ערמונית אנושי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במודלים של קרצינוגנזה של ערמונית באמצעות השראת סטרומה מוגדרת.
- ערך תפעולי: מקדם הדירות באמצעות נהלים סטנדרטיים לבידוד UGSM ולהשתלה בקפסולה הכלית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור חזרה מהירה של היפותזות גנטיות במערכת המבוססת על תאים אנושיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס לתעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תיקוף פונקציונלי בהקשר אפיתלי המגיב להורמונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח עוברי של מכרסמים והפרדת רקמות כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של UGSM.
- תלוי במודלים של מאחסנים עם מערכת חיסונית מוחלשת להשתלה בקפסולה הכלית ולהישרדות של השתל הזנוגראפי.
- מחייב תשתית כירורגית סטרילית וטיפול לאחר ניתוח להבטחת הישרדות חיית המאחסן.
- כולל עיבוד רקמות לאורך מספר ימים, הכולל דיסוציאציה אנזימטית ושלבי תרבית ליצירת סספנסיות של תאים בודדים.
- מוגבל בשל ההסתמכות הנוכחית על השתלות זנוגראפיות in vivo, עם פוטנציאל עתידי ליצירת בלוטות in vitro או שימוש ב-iPSC.
