Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen embriyolarından ürogenital sinüs mezenşimini (UGSM) izole etmek ve insan prostat epitelyumu oluşturabilen doku karışımlarını renal kapsüle implante etmektir. Bu işlem, öncelikle fare veya sıçan embriyolarından ürogenital sinüsün izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, ürogenital sinüs mezenşimi epitelden ayrıştırılır.

Ardından, ürogenital sinus mezenşiminin tek hücre süspansiyonları plüripoten kök hücrelerle birleştirilir. Son olarak, hücre karışımı bir konak fareyle renal kapsül altına implante edilir. Nihayetinde, insana özgü PSA ekspresyonunun doğrulanması yoluyla, fare böbreği üzerinde insan prostat epitelinin oluştuğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem prostat fonksiyonu ve hastalık başlangıcı hakkında bilgi sağlayabilse de, insan prostat tümörlerinin ksenogrefti ve tümör oluşturmak amacıyla haftalık tümörijenik hücre hatlarının indüklenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Zamanlanmış gebe bir fare veya sıçanı ötanize edip embriyoları izole ettikten sonra, onları amniyotik keseden ayırın, göbek kordonunu kesin ve buz gibi soğuk hanks içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dengeli tuz çözeltisini kullanın ve buz üzerinde tutun.

Bir embriyoyu 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve bolus seviyesinden ikiye bölmek için makas kullanın. Mideyi ve ince bağırsağı çıkarın; ardından dişi embriyoda böbreklerin kaudal kutuplarında bulunan yumurtalıkları veya erkek embriyoda mesane seviyesinde bulunan testisleri belirleyin. İşlemi bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin.

Mesaneyi ve abdomenin posterior duvarını açığa çıkarmak için abdominal duvarı Venedik makasıyla kesin. Üst genital kanalı bağlantılarından kurtarın ve göbek kordonunu serbest bırakın. Pubik kemiği Dumont ince uçlu pens ile kesin.

Küt diseksiyonla urogenital sinüsü ön duvardan ayırın. Urogenital sinüsün arka duvarını rektumdan ayırın ve urogenital sinüsü, mesane ile birlikte alt uçtan kesin. Ardından mesaneyi urogenital sinüsten ayırın.

Ürogenital sinüsü ve bloğu buz gibi soğuk HBSS içinde saklayın. Ürogenital sinüsü, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içinde %1 tripsin içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sindirimi nötralize etmek için tripsini uzaklaştırın ve %10 FBS ile DM A MF 12 besiyeri ekleyin.

Ardından, yapışkan mezenkimal kılıfı epitel tüpten dikkatlice ayırmak için bir iğne veya ince uçlu pens kullanın. Epitel tüpün bütünlüğünü korumak, mezenkimin epitel hücreleri tarafından kontamine edilme olasılığını azaltır. Bu kontaminasyon, kök hücre kaynaklı insan glandüler epitelinin yanı sıra kemirgen bezlerinin de oluşmasıyla sonuçlanabilir.

UGSM'yi; %10 FBS, %1 pen strep, %1 temel olmayan amino asitler ve bir nanomolar R 1 8 81 içeren DMM F 12 ortamı bulunan yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü 37 °C'de %5 CO2 ile gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün dokuyu 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peleti yıkamak için PBS kullanın.

PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra dokuyu D-M-A-M-F 12 içerisindeki %0,2 Kolajenaz ile yeniden süspanse edin ve 37 °C'de, hafif sallama ile bir saat boyunca inkübe edin; sindirilen dokuyu, homojen bir tek hücre karışımı haline gelene kadar üç kez güçlü bir şekilde vorteksleyin ve %10 FBS, %1 pen strep, %1 temel olmayan amino asitler ve bir nanomolar R 1 8 81 içeren D-M-A-M-F 12 besiyeri ekleyerek kolajenazı nötralize edin. Hücreleri 200 ×g'de pelletleyerek ve HBSS içerisinde yeniden süspanse ederek üç kez yıkayın. Son olarak, mezenkimal hücreleri DMM F 12 içerisinde yeniden süspanse edin ve transplantasyonu gerçekleştirmek için sayılarını belirlemek amacıyla bir hemositometre kullanın.

Steril bir cerrahi alan hazırlandıktan ve erkek atimik nude fare metin protokolüne uygun olarak IP ketamin ksilazin enjeksiyonu ile anestezi edildikten sonra, sedasyon düzeyini doğrulamak için ayak parmağı sıkıştırma testi uygulayın; gerekirse cerrahi bölgeyi tıraş ederek ve önce üç kez ardışık 70%alkol, ardından Betadine solüsyonu ile temizleyerek fareyi cerrahi işleme hazırlayın. Göz merhemi uyguladıktan sonra, sırt kısmında bir santimetrelik boyuna bir insizyon yapın ve abdominal duvarı 0,5 santimetrelik boyuna bir insizyonla kesmeye devam edin. Böbreği nazikçe karın boşluğundan dışarı itin ve nemli tutmak için steril salin damlaları kullanın.

Ardından, 27 gauge bir şırınga iğnesi kullanarak, hücre karışımı için bir enjeksiyon bölgesi oluşturmak amacıyla renal kapsülü nazikçe delin. Daha sonra 28 gauge bir şırınga iğnesini 10 µL hücre karışımı ile doldurun ve renal kapsülün altındaki bir bölgeye ulaşmak için iğneyi böbrek parankimine nüfuz edecek şekilde delme bölgesine yavaşça yerleştirin.

Renal kapsülün altına, böbrek üzerine bir bolus oluşturacak şekilde 10 µL hücresel karışım enjekte edin ve iğneyi geri çekin. Böbreği abdominal kaviteye geri yerleştirin ve peritonun kas tabakasını dört sıfır naylon sütürlerle sabitleyin. Cildi sütür veya zımba ile kapatın ve ciltteki kanları temizlemek için steril salin kullanın.

Burada, implantasyondan sekiz hafta sonra büyüyen bir xenograftın ultrason görüntüsü gösterilmektedir. Daire içine alınmış alan, böbrek yüzeyindeki xenograftı temsil etmektedir. Bu görüntüler, böbrek yüzeyindeki xenograft büyümesini kanıtlamaktadır.

12 hafta sonra, ürogenital sinüs mezenşimi yokluğunda implante edilen insan ES hücreleri büyük teratomlar oluştururken, tek başına implante edilen ürogenital sinüs mezenşimi belirgin herhangi bir yapı oluşturamaz. Merkezde gösterilmiştir. Bu şeklin panelleri, kök hücre türevli insan prostat epitelyumuna karşı yetişkin insan prostat dokusunun temsili immünohistokimyasal boyamalarıdır.

Burada solda gösterildiği gibi, bezler AR pozitif bir lüminal epitel tabakası içermektedir. Bu tabaka aynı zamanda PSA pozitiftir; ayrıca P 63 pozitif bir bazal epitel hücre tabakası ve nadir kromogranin A nöroendokrin hücreleri mevcuttur. Konak kastrasyonu sonrası negatif A-M-A-C-R boyanmasıyla gösterildiği üzere, bezler kanser değildir.

AR PSA pozitif luminal hücreler artık mevcut değildir ve bu durum karakteristik androjen bağımlılığını kanıtlamaktadır. Bu prosedürü uygularken, ürogenital sinüs mezenkimini epitelden ayırırken çok dikkatli olmayı hatırlamak önemlidir. Çünkü kontamine olan ürogenital sinüs epiteli bezler oluşturacak ve sonuçlarınızı potansiyel olarakleyletebilecektir.