Name: Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a extrair DNA genômico de sangue total usando a tecnologia TruTip automatizada no sistema Hamilton Star. Este método de alto rendimento elimina centrífugas e otimiza fluxos de trabalho clínicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Partes deste trabalho foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão R 44 AI072784. Agradecemos ao Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean, do Laboratório de Doenças Virais, Wadsworth Center, New York State Departamento de Saúde para virions gripe quantificados e acesso à clinicamente validado influenza em tempo real Os testes de PCR.

<ol><li>Boom, R., Sol, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Baker, M. P., Mitchell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+blood+using+a+novel+filter-based+DNA+purification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology.</a> BioTechniques. 31, 142-145 (2001).</li>
<li>Sinclair, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+bead+or+not+to+bead%3A+applications+of+magnetic+bead+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientist%22%5BJournal%5D)">To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology.</a> The Scientist. 12, 17-24 (1998).</li>
<li>Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+bead+purification+of+plasmid+template+DNA+for+high+throughput+sequencing+of+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes.</a> Nucl. Acids Res. 30, e32(2002).</li>
<li>Levison, P. R., Badger, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+of+magnetic+beads+for+use+in+nucleic+acid+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification.</a> J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).</li>
<li>Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+high-volume+extraction+method+for+viral+nucleic+acids+in+comparison+to+a+manual+procedure+with+preceding+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment.</a> Vox Sang. 89, 71-76 (2005).</li>
<li>Perelle, S., Cavellini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robotic+RNA+purification+protocol+based+on+the+NucliSens+easyMAG+for+real-time+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus+in+bottled+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water.</a> J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).</li>
<li>Riemann, K., Adamzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+manual+and+automated+nucleic+acid+extraction+from+whole-blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Lab.+Anal%22%5BJournal%5D)">Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples.</a> J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).</li>
<li>Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+automated+sample+preparation+instrument+and+consumable+device+for+isolation+and+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids.</a> J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).</li>
<li>Kessler, H., Mühlbauer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+nucleic+acid+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22MagNA+Pure+LC.+Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fully automated nucleic acid extraction.</a> MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).</li>
<li>Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+QIAGEN+automated+nucleic+acid+extraction+methods+for+CMV+quantitative+PCR+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing.</a> Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).</li>
<li>Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+automated+nucleic+acid+extraction+methods+with+manual+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction.</a> J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).</li>
<li>Kruhøffer, M., Voss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+QIAsymphony+SP+workstation+for+magnetic+particle-based+nucleic+acid+purification+from+different+sample+types+for+demanding+downstream+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications.</a> J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).</li>
<li>Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. , US7759112 (2010).</li>
<li>Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simple+influenza+RNA+extraction+from+nasopharyngeal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples.</a> J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).</li>
<li>Chan, K. H., Lai, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+%28H1N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1).</a> J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).</li>
<li>Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analytical+sensitivities+of+six+rapid+influenza+A+antigen+detection+test+kits+for+detection+of+influenza+A%5BTitle%5D)+AND+%22subtypes+H1N1%2C+H3N2+and%22%5BJournal%5D)">Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A.</a> subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).</li>
<li>Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+diagnosis+of+fetal+aneuploidy+by+shotgun+sequencing+DNA+from+maternal+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).</li>
</ol>

Os autores são funcionários da Akonni Biosystems, Inc., que produzem materiais utilizados neste artigo. Acesso gratuito e Produção deste artigo é patrocinado pela Akonni Biosystems, Inc.

A simplicidade do conceito TruTip e fluxo de trabalho (Figura 1) torna prontamente adaptados, automatizado, eficiente e eficaz para um número de matrizes de amostras clínicas, os volumes de amostras de entrada, e os sistemas de manuseamento de líquidos. Deve ser reconhecido, contudo, que cada amostra clínica é único, e variará de um para o outro na viscosidade, partículas, muco, os contaminantes da superfície, microbianos e / ou fundos genéticos humanos. Dadas as variações esperadas na composição da amostra clínica e utilizações previstas para um protocolo de preparação da amostra TruTip automatizado, pode ser necessário modificar alguns passos em um procedimento TruTip, a fim de alcançar os resultados desejados para um tipo de amostra específica. Independentemente do tipo de amostra, no entanto, os parâmetros TruTip que normalmente têm o efeito mais significativo sobre a pureza de ácido nucleico e / ou recuperação incluem: <ol><li> Exemplo de mistura e homogeneização com um tampão de lise (e álcool). Enquanto TruTips ter um revamente grande tamanho dos poros, a homogeneização da amostra e de liquefacção é muito importante para a lise eficiente de células, e os subsequentes passos de ligação ao TruTip monólito. Com um ligado homogénea e bem liquefeito, as amostras podem mover-se através do TruTip com taxas de fluxo mais elevadas, o que reduz o tempo global de processamento da amostra. O grande volume de plasma protocolo demonstra o potencial de usuários para homogeneizar cuidadosamente e liquefazer amostras difíceis (on-line ou off-line), apesar do grande volume de amostra de entrada. </li><li> As taxas de fluxo. Caudais inferiores durante ligação de ácido nucleico ou de eluição normalmente resultam em rendimentos mais elevados de ácido nucleico, embora à custa do tempo total de processamento. Taxas de fluxo mais lentas também pode reduzir a extensão de corte de DNA. </li><li> O número de ciclos. Número óptimo de aspiração e dispensar ciclos depende do tipo de amostra, o volume total da amostra, e as taxas de fluxo. Passo 1 da Figura 1 é tipicamente o ponto no qual numbe cicloRS (e as taxas de fluxo) pode exigir alguma optimização empírica, com amostras, tais como aspirado nasofaríngeo (Figura 5), que representa um dos lisados ​​mais desafiantes para optimizar devido à gama de viscosidades NPA de diferentes pacientes. </li><li> Secagem. Completa secagem da TruTip monólito é imperativo evitar que a partir de solventes orgânicos residuais co-eluindo com a amostra de ácido nucleico purificado e os processos a jusante, ou ensaios de inibição. Porque TruTip não é seca por meio de centrifugação ou filtração sob vácuo, é importante para maximizar tanto a taxa de fluxo e os números dos ciclos durante a etapa de secagem. Às vezes não é uma gotícula de solução de lavagem residual no terminal de TruTip após os ciclos de secagem está completada. Hamilton O robot tem capacidade para desempenhar um &quot;toque ponta&quot; do lado do poço, para libertar a gota, assegurando assim uma eluição livre de solvente. O sistema epMotion não tem esse recurso, mas uma pré-lavagem do terminal TruTip em ellução tampão pode ser programada para obter o mesmo efeito. </li></ol> Devido à geometria, material da ponta de pipeta, e método de fixação dos braços robóticos de canal são únicos para cada fabricante do instrumento, um constructo TruTip diferente é necessária para cada sistema de manuseamento de líquidos. As dimensões do monólito TruTip (diâmetro, espessura e tamanho de poro) que se correlacionam com a capacidade de ligação de ácido nucleico (e eficiências de eluição), como é esperado para qualquer técnica de extracção em fase sólida. Enquanto grossas (&gt; 4 mm) de matrizes pode ser incorporado em um 1 mL TruTip para aumentar a capacidade de ligação de ácido nucleico para as amostras de grandes volumes e / ou igualar a capacidade de ligação entre os formatos TruTip específicas, existe uma compensação entre a espessura TruTip e taxas de fluxo durante o passo inicial de ligação (na presença de lisados ​​brutos). Assim, é por vezes vantajoso incorporar monólitos de maior diâmetro em pontas de pipetas de maior volume para os passos iniciais de um protocolo automático (por exemplo, &lt;/ Em&gt; os 5 ml de Hamilton / Akonni TruTips para extrações de grande volume). Dadas as configurações TruTip específicas ditadas pelos fabricantes de robôs de manipulação de líquidos, no entanto, não necessariamente esperar rendimentos ácidos nucleicos TruTip ser idêntica em todas as plataformas de manuseio de líquidos de diferentes fabricantes, ou em diferentes tamanhos TruTip. As amostras clínicas (por definição) irá conter quantidades significativas de DNA genómico humano, a menos que eles são adquiridos a partir de locais normalmente estéreis (por exemplo, fluido espinhal cerebral). Por vezes, o DNA genómico humano é desejada (tal como na Figura 6), enquanto que em outras aplicações, o DNA humano representa um fundo genómico indesejado (tal como para a Figura 5). A presença de ADN de fundo não é normalmente problemática contanto que a quantidade total de ácido nucleico na amostra não exceda a capacidade de ligação do monólito, e o ADN do fundo pode servir como um transportador, se o alvo desejado nucleicoácido está presente em quantidades vestigiais. O objectivo do protocolo de extracção de plasma de grande volume (Figura 7) é isolar (fragmentada) de ADN fetal na presença de um excesso de 10-20 vezes de ADN materno, o qual é semelhante ao objectivo a preparação da amostra de teste de doenças infecciosas, excepto que As sequências são altamente congruente e só pode ser distinguido por testes moleculares altamente específica e / ou o tamanho da discriminação. Neste caso, o ADN total em circulação é isolado utilizando 5 ml de uma TruTip, e o ADN fetal de alto peso molecular e de baixo peso molecular são separadas por meio de posterior subsequente ligação e eluição com um 1 ml TruTip alterando as condições do tampão de ligação. Separação por tamanhos e de enriquecimento selectivo de ácidos nucleicos alvo com base na sua ligação e as propriedades de eluição a um monolito de sílica é um modo significativamente diferente da acção que a alcançada por membranas ou colunas de exclusão de tamanho de spin. Tamanho de separação e enriquecimento do DNA microbiano a partir de ADN genómico humano pode ser umccomplished em futuras aplicações via personalizando ligação TruTip e buffers de eluição. Os protocolos automatizados demonstrado aqui sublinhar a utilidade do próprio TruTip monólito para o processamento de diversas amostras clínicas, e como ele pode ser adaptado para grandes volumes específicos e robôs de manipulação de líquidos. Os métodos simplificados tipicamente resultar em protocolos de extracção mais rápido em comparação com outros sistemas automatizados. A simplicidade da tecnologia TruTip, no entanto, também oferece algumas vantagens de custo para os interessados ​​na compra de um novo sistema de purificação, automatizado ácido nucleico, porque o hardware primário necessário para automatizar procedimentos TruTip é o próprio braço canal pipeta ao invés de barras magnéticas, sistemas de vácuo ou on-board centrífugas. Utilizando placas de reagentes pré-cheias também podem reduzir o espaço e consumíveis necessários, eo dobro do rendimento per prazo. Minimizando o espaço deck com protocolos TruTip também permite que os usuários avançados para integrar a montante ou dprocessos automatizados ownstream com o TruTip. Por exemplo solução easyBlood de Hamilton para fraccionar sangue total podem ser incorporados com o método de extracção TruTip automatizado, o que iria simplificar significativamente os processos de bio-bancárias. Processos pós-extração, como a quantificação de ácidos nucleicos, a normalização, a PCR set-up, ou sequenciamento de DNA também são facilmente integrados com TruTip nas maiores plataformas de manipulação de líquidos.

Purificação de ácido nucleico, é necessário para os diagnósticos moleculares mais, a pesquisa usar apenas, e aplicações de ciências da vida. Várias abordagens têm emergido desde o tempo de extracções com fenol / clorofórmio, muitos dos quais se baseiam no princípio fundamental da ligação à sílica, na presença de sais caotrópicos um ácido nucleico. O processo de extração foi simplificada e automatizada através do uso de vários formatos e talão de membrana baseados, com filtros de rotação, esferas magnéticas e abordagens afins dominam setor de ciências da vida (ver exemplos em 2-13). Apesar de eficaz, as partículas e as membranas têm limitações conhecidas quando confrontado com matrizes clínicos desafiadores. Por exemplo, as membranas e colunas baseadas em grânulo são compatíveis, têm pequenas dimensões de poros (assim, pressões elevadas de volta), e requerem algum tipo de apoio, a fim de ser processada por um sistema de centrifugação ou de vácuo. As características físicas das membranas e resultam em colunas grânulofluídica resistência significativa, o que limita o tipo de amostras que podem ser processadas de forma eficiente sem obstruir o consumo, e / ou o volume total de amostras (de entrada), que pode ser uni-direccionalmente processados ​​através do percurso de escoamento. Inversamente, as partículas magnéticas deve ser distribuído em toda a amostra por agitação. A necessidade de distribuir homogeneamente as partículas magnéticas dentro de uma solução limita o volume de amostra total de entrada que pode ser processado com consumíveis grânulo mais magnéticas. Atributos amostra clínica (tal como a viscosidade ou a complexidade) pode levar a uma concentração de partículas magnéticas ineficiente do lado de um tubo ou haste. Além disso, as partículas finas de sílica podem desprender das esferas durante o processo de extracção, a perder a sua magnetização e contaminar a amostra final. A tecnologia TruTip foi desenvolvido para superar algumas dessas limitações de ácidos nucleicos de amostras de processamento e limitações 14. Ao incorporar um monólito poroso dentro de umponteira, fluídico contrapressão é reduzida, o que permite o controle de fluxo de vácuo (ou seja, pipeta de aspiração). Esta característica permite que o processo de extracção e de instrumentação necessária para purificar ácidos nucleicos a partir de tipos de amostra difíceis de ser muito simplificada (Figura 1). A geometria e porosidade do monólito é adaptada para minimizar o entupimento, enquanto que a espessura do monólito proporciona uma capacidade de ligação de ácido nucleico suficiente para volumes de amostra de 1,0 a 5,0 ml. Fluxo bidireccional da amostra, durante a aspiração e distribuição permite tempos de residência prolongados entre o extracto da amostra e o monólito de ligação para recuperação de ácido nucleico e a eluição eficiente e permite que volumes de amostra relativamente grandes a serem processados ​​que exceda a capacidade do volume da ponta da pipeta em si. Nós relatamos anteriormente, o desenvolvimento e aplicação de um procedimento TruTip manual para purificar RNA de gripe a partir de amostras de nasofaringe usando uma única ou multi-canal Rainin pipeta 15. Eficiências de extracção equivalentes, foram obtidas entre automatizado QIAcube e métodos TruTip manuais em 10 6 cópias do gene da gripe A por ml aspirado nasofaríngeo. O objetivo deste estudo foi demonstrar os procedimentos de média e alta taxa de transferência, automatizados TruTip purificação de ácidos nucleicos para aspirado nasofaríngeo (NPA) e outros tipos de amostras clínicas relevantes, utilizando robôs para manipulação de líquidos comumente encontrados em laboratórios clínicos de referência.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Material &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de Extração de Influenza TruTip (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Acetona 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório de reagentes, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poços profundos 96/2.000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Ponteiras com filtro, 1.000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipamento&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema epMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de dispensação TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-reservatório</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Reagentes e equipamentos para extração automatizada de RNA de NPA.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Material &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de Extração de gDNA de Sangue TruTip (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Porta-ponteiras CO-RE 96 de 1 ml filtrada</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>Porta-ponteiras CO-RE 96 de 1 ml não filtrada</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>Balança de reagentes de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poços profundos de 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>Balança de reagentes</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipamento&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema Hamilton STAR</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>Canais de pipetagem independentes de 1 ml / Braço modular</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>Cabeçote de 96 canais de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>Porta-ponteiras</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Porta-amostras/Inserções</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>Porta-placas</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Porta-múltiplo</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de agitação e aquecimento HHS2</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>Porta-porta-reservatório</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Reagentes e equipamentos para extração de DNA genômico em 96 poços a partir de sangue total.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Material &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de Extração de DNA Circulante TruTip R+D (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>Consulte para informações</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras filtradas de 4 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras não filtradas de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>Placas de poços profundos 96</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Balanças de reagentes de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Balanças de reagentes de 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>Balanças de reagentes de grande volume com 96 posições</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipamento&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Base do Workstation STARplus Autoload / Módulo de deck</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>Canais de pipetagem independentes de 1 ml / Braço</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>Canal independente de 5 ml / Braço modular</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>Porta-placas</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Porta-múltiplo</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Porta-porta-reservatório para balanças de reagentes de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>Porta-balança de reagentes de 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>Porta-ponteiras</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Porta-tubos de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>Porta-amostras com 24 posições</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>Porta-amostras com 32 posições</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 3. &lt;/strong&gt; Reagentes e equipamentos para extração de DNA de grande volume a partir de plasma.</td></tr></tbody></table>

alto rendimento, extração automatizada de dna e rna de amostras clínicas utilizando a tecnologia trutip em robots liquid handling comuns

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. A geometria do monólito pode ser adaptado para ponteiras específicas que variam de volume de 1,0 a 5,0 ml. A grande porosidade do monólito permite amostras viscosas ou complexas para passar facilmente através dele com contrapressão fluídica mínima. Fluxo bidireccional maximiza o tempo de residência entre o monolito e amostra, e permite grandes volumes de amostra a ser processado dentro de uma única TruTip. Os passos fundamentais, independentemente do volume de amostra, ou de geometria TruTip incluem a lise celular, a ligação para os poros interiores do TruTip monólito de ácido nucleico, embora a lavagem de componentes de amostra não ligados e tampões de lise, e eluindo os ácidos nucleicos purificados e concentrados em um tampão adequado. Os atributos e adaptabilidade de TruTip são demonstrados em três protocolos de processamento de amostras clínicas automatizados usando um epMotion Eppendorf 5070, Hamilton STAR e Starplus robôs de manipulação de líquidos, incluindo o isolamento de RNA a partir de aspirado nasofaríngeo, o isolamento de DNA genómico a partir de sangue total, e de extracção do ADN fetal e de enriquecimento a partir de grandes volumes de plasma materno (respectivamente).

Dados de PCR em tempo real para influenza extração de RNA a partir de NPA são mostrados na Figura 5A. A eficiência da extracção do ácido nucleico estimado é semelhante aos resultados obtidos com a versão manual do protocolo 15. Uma resposta linear em média de valores de C T pode ser observada entre 10 4 e 10 6 ml -1 cópias do gene alterado gripe (R 2 = 0,99 e 0,98 para influenza A e B, respectivamente), com desvios padrão da média C t valores inferiores a 1 ciclo. A ausência de contaminação cruzada com o sistema epMotion é demonstrado na Figura 5B, em que 12 amostras positivas NPA contendo 10 6 ml -1 cópias do gene ANF foram intercalados com espaços tampão 12. A média de C t para os controles positivos foi de 30,16 ± 0,14, e todos os espaços em branco tampão foram negativos. O tempo total de processamento da amostra é de 16, 28 e 40 min para 8, 16 e 24 amostras, respectivamente.Porque um aspirado nasofaríngeo clínico típico ou chumaço conterá 10 cópias do gene 7 ml -1 (assumindo 1000 viriões por TCID 50 e 16&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 gripe 17), o protocolo epMotion automatizada está prevista para ser eficaz na maioria de espécimes clínicos NPA. Dada a variedade de testes moleculares realizados em ADN genómico humano, o objectivo primário de extracção de ácido nucleico a partir de sangue total é o de produzir, o ADN genómico sem contaminantes de alto peso molecular. O protocolo automático para 96 amostras é concluída dentro de 1 hora, o que é uma melhoria em relação a outros sistemas automáticos (por exemplo, a Promega MagneSil = 90 min e Qiagen QIAamp DNA Sangue BioRobot sistema MDx = 2,5 horas). Figura 6A mostra os perfis de absorvância no UV / VIS 45 amostras de sangue positivas transformadas simultaneamente com 45 brancos de reagentes sobre o protocolo de Hamilton em estrela, com uma média A <sub&gt; Rácio de 1,96 260/280 e uma proporção média de 1,93 260/230. Um A 260/280 proporção entre 1,7-2,0 e uma proporção 260/230&gt; 1,7 são geralmente indicativos de ADN muito pura, isento de sais residuais, proteínas ou solventes, e aceitável para aplicações moleculares mais a jusante. O gel de agarose a 1% na Figura 6B mostra que a gDNA resultante é de elevado peso molecular (&gt; 24 kb), com corte mínima. O rendimento médio de ácido nucleico a partir de todo o conjunto de 45 amostras positivas é de 5,26 ± 0,46 ug de ADN humano por 200 uL de sangue total, com base na Life Technologies Quantifiler Quantificação do ADN humano Kit. Estudos de contaminação cruzada semelhantes àqueles mostrados na Figura 5B foram realizadas com placas de controlo negativo de tampão intercaladas com as amostras positivas e extraída em paralelo, todos os espaços em branco foram novamente negativos por PCR (não mostrado). A purificada gDNA também é adequado para numerosas outras análises baseadas em PCR (não mostrado). Resultados em tempo real a partir de oito amostras idênticas de uma amostra de plasma materno reunidas processado com o procedimento TruTip grande volume são mostrados na Figura 7. O protocolo completo (incluindo o off-line de proteinase K de incubação) é terminada em cerca de 2,5 h, semelhante ao manual Qiagen Circulação Nucleic Acids Kit (kit de extracção automatizadas não são ainda comparáveis ​​disponíveis). Os valores médios de C T mais de todas as repetições são 34,58 ± 0,66 e 29,76 ± 0,50 para o feto macho (CHY) e o ADN total (CH1), respectivamente, o que demonstra excelente repetibilidade do método de extracção automática. A concentração de ADN fetal no pool de DNA total (em equivalentes do genoma), é calculado com base na comparação de análise de ponto de ajuste de padrões, com a média de ADN fetal resultando% em todas as amostras de 2,8%. A DNA real fetal% para esta amostra é desconhecido, porque as amostras foram recolhidas antes de realizar a extracção. Composição do DNA fetalAs amostras de plasma em não-combinadas extraído utilizando o método TruTip são tipicamente cerca de 1,5 vezes mais elevado comparado com os resultados com um Qiagen Circulação Nucleic Acids Kit (não mostrado). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figura 1. O processo de extracção TruTip e fluxo de trabalho, independentemente do sistema de manuseamento de líquidos. Outros passos de preparação de amostra ou de processamento de líquidos pode ser incorporada rotinas automatizadas, dependendo das capacidades do aparelho de manipulação de líquidos específicos e de software. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 layout da placa de amostra. (B) Arranjo de reagentes / Consumaveis na mesa de trabalho. amostra A placa pode ser configurado para até 24 amostras (colunas 1, 5 e 9, respectivamente), embora a epMotion só irá processar um máximo de 8 amostras simultaneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figura 3. Hamilton layout de convés ESTRELA para a purificação de DNA genômico de sangue total (sem escala) Baralho posição 1 = Hamilton 1 ml dicas filtradas; Hamilton. 2 = 1 ml dicas não-filtradas, 3 = Akonni / Hamilton de 1 ml LPT dois milímetros TruTips, 4 = entrada de portadores de amostras de sangue (tubos de coleta de sangue ou tubos de microcentrífuga), 5-9 = 290 ml depressões reagentes para Lise F, etanol, solução tampão J, K e Wash Buffer eluição tampão A2, respectivamente, 10 = 96 deep prato bem Binding; 11 = 96 poço profundo Lave J; 12 = 96 poço profundo Lave K; 13 = 96 prato eluição poço profundo; 14 = Hamilton HHS2 aquecedor / agitador com Nunc 96 placa de incubação poço profundo; 15 = 50 ml através de reagente contendo proteinase K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Figura 4. Hamilton disposição Starplus convés para a purificação de ADN a partir de amostras de plasma de grande volume (não à escala). O sistema está equipado com canais de 8 x 5 ml e 8 x 1 ml, os canais (não mostrado no esquema da prancha). Baralho Posição 1 = Hamilton 4 ml dicas filtradas, 2 = Akonni / Hamilton de 5 ml TruTips, 3 = amostras de plasma de origem, 4 = 50 ml tubos cônicos, 5 = 120 ml depressões reagente contendo CN-W1, W2 e CN-CN-W4 REAGEnts, ​​6 = calhas reagentes de baixo volume contendo proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB e CN-W3 reagentes, 7 = 290 ml através reagente contendo reagente CN-L1; 8 = 290 ml através reagente contendo CN -B1 reagente; 9 = placas de 96 poços profundos para a etapa 1, 10 = 96 placas de poço profundo para a etapa 2, 11 = portadores de amostra para purificada, produto final; 12 = Hamilton 1 ml dicas não filtradas, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figura 5. (A). Real-time PCR resultados da extração TruTip automatizada de vírus influenza adicionado em aspirado nasofaríngeo (NPA). APN = volume de 100 ul de entrada, o volume de eluição = 50 ul. Os resultados são a média de três e replicamxtractions a partir de 5 NPA fundos distintos (n = 15) por o nível de diluição e de destino da gripe. qPCR foi realizada no sistema LightCycler 480 com condições de ensaio descritas anteriormente 15. (B) Sem contaminação cruzada é detectado quando 12 amostras positivas NPA são intercaladas sem controles de modelo e submetidos a processo de extração automática. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Figura 6. Resultado da extracção de ADN genómico humana a partir de sangue inteiro a.) Vestígios de UV-visível a partir de 1000 NanoDrop (ThermoFisher) seleccionados aleatoriamente a partir de 10 repetições. B) 1% de gel de agarose de gDNA TruTip purificada. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng purificada gDNA de quatro aleatoriamente selecionado repetições. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figura 7. Em tempo real os resultados da PCR de oito replicar extrações TruTip de livremente circular de DNA de amostras de plasma. Denotados por asteriscos (* ou **) foram extraídos em dias separados. CHY quantifica DNA fetal masculino e CH1 quantifica total de DNA presente (fetal e maternal). qPCR foi realizada num sistema de 480 LightCycler (Roche), com o objectivo de ensaios publicados anteriormente CHY e CH1 18.

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. Por conseguinte, a preparação da amostra é de formato compatível com os instrumentos de manipulação mais líquidos, e pode ser usado para muitos médio para aplicações clínicas de alto rendimento e tipos de amostras.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar o DNA genômico humano de sangue total, utilizando a tecnologia de extração com ponteiras True, no sistema automatizado Hamilton Star Liquid Handling. Para alcançar esse objetivo, as células são lisadas em uma solução composta por tampão de lise, proteinase K e etanol, que é aspirada e dispensada através das ponteiras True várias vezes, promovendo a ligação do DNA à matriz da ponteira. Em seguida, dois tampões de lavagem distintos são passados pelas ponteiras True para remover proteínas residuais, tampão de lise e outros contaminantes dos ácidos nucleicos ligados.No terceiro passo, a matriz de ligação da ponta verdadeira é seca aspirando e dispensando ar várias vezes para evaporar qualquer tampão de lavagem remanescente; na etapa final, o tampão ilusão é movimentado para frente e para trás através da matriz de ligação para liberar o DNA da matriz. Utilizando a tecnologia de ponta verdadeira, o DNA genômico de alto peso molecular, livre de contaminantes, é assim extraído e pode ser confirmado por absorção UV-vis, eletroforese em gel e PCR quantitativa ou sequenciamento. As vantagens da ponta verdadeira em comparação com outros métodos de preparação de amostras baseados em colunas de centrifugação ou partículas magnéticas são que a Tru Tip é fácil de automatizar.Não requer sistemas caros com centrífugas e hastes magnéticas, e o fluxo de trabalho simples economiza espaço valioso na bancada. Embora hoje nos concentremos em sangue total, o Tru Tip pode ser aplicado a outras aplicações de amostras de DNA genômico, bem como ao RNA viral de amostras clínicas de swab ou ao isolamento de DNA livre de células do plasma, para citar algumas. Demonstrará o procedimento Dane Brady, engenheiro de automação do nosso laboratório, que teve papel fundamental no desenvolvimento do procedimento de extração com Tru Tip na Estação de Tratamento de Líquidos Hamilton.Neste protocolo, um robô de manipulação líquida Hamilton Star extrai simultaneamente DNA de 96 poços de sangue total. O Hamilton Star possui uma unidade opcional de agitação com aquecimento na plataforma, o que é importante para a digestão enzimática de certas matrizes clínicas, como sangue total. Como o sistema pode ser equipado com uma cabeça de pipetagem de 96 canais, há uma placa de 96 poços dedicada para cada um dos passos verdadeiros com ponteiras e reagentes.Primeiro, ligue o equipamento associado ao robô Hamilton Star e o computador. Abra o software Hamilton Run Control. Abra o arquivo de execução fornecido pela ACON para 96 amostras.Agora configure o layout do deck de estrela seguindo o diagrama. Coloque ponteiras filtradas de um mililitro em todas as posições marcadas como um; na posição dois, coloque ponteiras não filtradas de um mililitro; na posição três, coloque uma ponteira Conni Hamilton de um mililitro LPT com pontas verdadeiras de dois milímetros. Continue consultando o gráfico para preencher as posições restantes, da cinco à doze, com os LabWare necessários, mas ainda não carregue as amostras.Agora distribua os reagentes: 75 mililitros do tampão de lise e ligação. F deve ser carregado na posição cinco do reservatório. Alternativamente, placas pré-preenchidas com tampões também podem ser utilizadas para agilizar a configuração e simplificar o layout da placa.Continue carregando o robô conforme apropriado. Por fim, remova as tampas dos tubos de sangue e coloque-os nas grades do portador de amostras ou na posição quatro da bancada. Coloque a amostra um na parte traseira do portador mais à esquerda e prossiga sequencialmente ao longo de cada portador, com a amostra 96 terminando na posição dianteira direita.Após o carregamento de todas as amostras, deixe-as equilibrar à temperatura ambiente. Como o protocolo é totalmente automatizado, há pouca possibilidade de erro operacional. As amostras precisam ser colocadas na ordem correta no suporte, mas a codificação por barras pode ser implementada para garantir o rastreamento adequado das amostras.Para iniciar um script automatizado, selecione o botão de reprodução no canto superior esquerdo da janela do arquivo de execução e insira o número de amostras que estão sendo processadas. O primeiro passo executado pelo script é transferir 80 microlitros de proteinase K para a placa de incubação na posição 14 do módulo aquecedor agitador. Em seguida, o script dispensa 200 microlitros de amostra em cada poço da placa de incubação utilizando o braço de oito canais.Em seguida, são dispensados 600 microlitros do tampão de lise F em cada poço da placa de incubação utilizando o braço de 96 canais. O script então mistura a solução por 10 ciclos e incuba por 20 minutos a 70 graus Celsius e 500 RPM na placa de poços profundos, sendo que a temperatura é de apenas 60 Celsius, dentro da faixa de atividade da proteinase K. Enquanto as amostras estão em incubação, o sistema de manipulação de líquidos continua operando, dispensando os reagentes de extração e eluição dos reservatórios principais para as respectivas placas de 96 poços; 100 microlitros do tampão Elucian A são adicionados a cada poço da placa de poços profundos.Na posição 13, são depositados 800 microlitros de etanol em cada poço da placa de poços profundos. Na posição 10, 1,6 mililitro de tampão de lavagem K é adicionado a cada poço da placa de poços profundos na posição 12 e 1,6 mililitro de tampão de lavagem J é adicionado a cada poço da placa de poços profundos na posição 11. Após a incubação de 20 minutos, a mistura da amostra é transferida da placa de incubação para a placa de poços profundos contendo etanol na posição 10, onde é misturada por 12 ciclos de pipetagem.Em todo o processo, as ponteiras de reagentes são descartadas no recipiente de resíduos conforme necessário. O programa prossegue do processo de lise para a extração de DNA carregando primeiro 96 ponteiras verdadeiras da posição três da plataforma. O próximo passo é aspirar e dispensar as amostras na posição 10 por 10 ciclos, ligando assim os ácidos nucleicos ao monólito da ponteira verdadeira.Em seguida, as pontas verdadeiras movem-se para a posição 11, onde o tampão de lavagem J é passado sobre o monólito cinco vezes para remover resíduos de lise, tampão e matriz da amostra. Então, as pontas verdadeiras movem-se para a posição 12, onde o tampão de lavagem K é passado através delas cinco vezes para remover proteínas e outros contaminantes dos ácidos nucleicos retidos. Em seguida, as pontas verdadeiras são secadas ao ar, realizando 80 ciclos em alta velocidade acima da placa de lavagem.Agora, as ponteiras verdadeiras movem-se para a posição 13, onde o tampão elucian passa por elas duas vezes em cinco ciclos, liberando o DNA na placa de poços profundos. As ponteiras verdadeiras são agora ejetadas para o recipiente de resíduos. Agora o programa foi concluído.Remova a placa de eluição do instrumento e transfira as amostras extraídas para os tubos apropriados para armazenamento ou aplicações posteriores. O programa também pode ser personalizado para transferir automaticamente as amostras finais para o tubo ou placa desejado em apenas uma hora. O sistema automatizado extraiu DNA genômico de 96 amostras de sangue utilizando o robô.Os perfis de absorbância de 45 amostras de sangue positivas foram processados simultaneamente com 45 brancos de reagente. A razão média entre 260 e 280 foi de 1,96, e a razão média entre 260 e 230 foi de 1,93, sugerindo amostras puras em um gel de agarose a 1%. Amostras aleatórias apresentaram alto peso molecular com cisalhamento mínimo.O rendimento médio foi de cerca de cinco microgramas de DNA por 200 microlitros de sangue total. Ao otimizar o protocolo automatizado com ponteiras verdadeiras, toma-se especial cuidado para garantir que não haja contaminação cruzada entre poços. A PCR em tempo real mostra separação nítida entre positivos e negativos, conforme mostrado aqui.Para extrações de RNA, a extração completa de 96 amostras pode ser concluída em menos de uma hora, exigindo tempo mínimo de manipulação manual. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar DNA genômico humano de sangue total utilizando a Tecnologia TRU Automatizada no Workstation de Manipulação de Líquidos Hamilton Star.

high-throughput-automated-extraction-dna-rna-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descrevemos a seguir os processos de extracção e purificação de ARNm e metabolitos...

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

A Purificação de Afinidade de Ribosssomos Traduzível (TRAP) é capaz de capturar a tradução específica do tipo de célula do mRNA. Aqui relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado ao isolamento de mRNA em populações de células raras de embriões de Drosophila.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Aqui, um fluxo de trabalho automatizado para realizar a montagem de "dispositivo" modular do DNA usando um método de montagem clonagem de DNA modular em robôs de manipulação de líquido é apresentado. O protocolo usa uma ferramenta de software intuitivo para gerar picklists líquido manipulador para combinatória DNA dispositivo biblioteca geração, que demonstramos usando duas plataformas de manipulação de líquidos.

Robótico líquido manipulação montagem de dispositivos modulares DNA automática

Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Protocolo detalhado e três scripts Python são fornecidos para operar um sistema de manuseio líquido robótico de código aberto para realizar a preparação semi-automatizada de amostras de proteína para experimentos de espectrometria de massa, cobrindo a remoção de detergentes, digestão de proteínas e etapas de desalização de peptídeos.

Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

O protocolo descreve um método de diagnóstico SARS-CoV-2 que utiliza a automação de código aberto para realizar testes moleculares RT-qPCR de amostras de saliva. Essa abordagem escalável pode ser aplicada à vigilância clínica em saúde pública, bem como ao aumento da capacidade de laboratórios universitários menores.

Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

Este protocolo descreve um método custo-efetivo para acelerar a extração de DNA plasmídico. Ao utilizar racks personalizados impressos em 3D compatíveis com rotores padrão de placas de balde oscilante, os pesquisadores podem processar até 48 colunas de rotação com tampas ou até 116 colunas de spin sem tampas simultaneamente, reduzindo significativamente o tempo de manuseio em comparação com métodos manuais de microcentrífuga.

Extração de DNA em Coluna de Média Capacidade Usando Racks de 24 Poços

Aprenda a extrair DNA genômico de sangue total usando a tecnologia TruTip automatizada no sistema Hamilton Star. Este método de alto rendimento elimina centrífugas e otimiza fluxos de trabalho clínicos.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns (Vídeo) | JoVE Journal

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

Explorar mais vídeos