斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

本实验的总体目标是评估胚胎期斑马鱼的脑血管结构。首先收集受精的斑马鱼卵并设置处理条件。经过三天的生长期后，处死斑马鱼，进行固定，并小心摘除一只眼睛，随后将样本置于盖玻片上进行封片。

然后通过共聚焦显微镜对脑血管系统进行成像。最后，使用开源软件生成血管系统的三维重建图像。最终，通过对重建图像的分析，确定不同处理条件对血管分支和密度的影响。

在发育中的斑马鱼大脑中。该技术可评估胚胎期斑马鱼的整个血管系统。这使我们能够在器官系统水平上研究淀粉样蛋白β的生物学特性。

该方法的可视化演示至关重要，因为解剖和图像分析技术难度较高，难以掌握。首先，在28.5摄氏度、14小时光照和10小时黑暗的循环条件下培育表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的转基因斑马鱼品系，使其在目标组织中表达。本示例中，使用在血管内皮细胞中表达EGFP的转基因鱼，在收集卵子前一晚将雄鱼和雌鱼放入底部带网格的交配缸中。次日清晨，移除隔板，让鱼类交配，并每15分钟检查一次是否有卵产生。

使用滤网收集卵子后，用 E3 胚胎培养液清洗三次，再用 E3 胚胎培养液将卵子转移至 100 毫米的培养皿中，在 28°C 下孵育以调控脑血管分支。从受精后 24 小时开始，加入溶于 DMSO 的化学物质，如 γ-分泌酶抑制剂。如需要，可添加 0.03% PTU 以抑制色素形成。

将胚胎转移至12孔板的孔中，于28.5°C孵育，直至胚胎发育至所需阶段。用三卡因处死胚胎，并于4°C用醛类固定液过夜固定。将胚胎置于PBS中，避光保存于4°C。

要从胚胎中取出眼球，使用 sharpened tungsten needle 切割连接一只眼睛的周围组织，然后切断肌肉，最后切断视神经以摘除眼球。眼球取出后，将胚胎翻转，使其空出的眼窝朝下并接触盖玻片。

加入一滴 3%甲基纤维素以固定胚胎位置，并覆盖整个胚胎，防止干燥。使用倒置共聚焦显微镜配备 20 倍平场复消色差物镜进行成像时，应立即对胚胎成像；许多成像系统仅能在此样本中半程深度处分辨出血管结构。若出现此情况，需重新悬浮胚胎于 PBS 中，并将其重新安装至对侧，以进行进一步成像，随后使用 ImageJ 进行脑血管图像的三维重建，该软件已针对三维渲染进行了优化。

通过依次点击插件、Loci、Bio-Formats 导入器来导入共聚焦图像序列，然后选择尼康图像序列文件，选择“以超堆栈形式查看堆栈”并设置颜色模式为灰度。然后勾选自动缩放和拆分通道。这些设置将打开四个独立的通道面板。

关闭除文件名后跟 c 等于 1 的 16 位图像之外的所有图像。通过使用底部的滚动选项卡浏览切片，找到包含目标区域或结构的切片，然后进入图像→调整→阈值进行调节。

在弹出的面板中，将上方滑块向左滑动，使结构在背景上清晰可见，同时保持下方滑块位置不变，以创建一个新的八位图像。选择“黑白”，然后选择“暗色背景”。

除非每张切片需要不同的调整，否则请勿选择“为每张图像计算阈值”。接下来，进入插件 3D 查看器，将阈值设为零，重采样因子设为一或二，并取消选中红色和蓝色颜色框，以生成绿色的 3D 输出。否则，将生成白色的渲染图像。

然后选择“应用”。使用鼠标和键盘控制旋转、转动和缩放三维图像，并在任意时刻通过菜单中的“捕获”选项保存静态图像。

屏幕上图像框的尺寸决定了生成图像的像素大小，因此若需要高分辨率图像，可通过拖动右下角来增大图像框。通过选择“视图记录 360 度旋转”来创建旋转的 3D 动画。最后，将文件保存为多种可用格式之一，并使用免费开源媒体播放器 VLC 来观看 3D 内容。

血管结构的重建为斑马鱼发育提供了全面且视觉上引人注目的视角。图中显示的是受精后六天斑马鱼胚胎中表达EGFP的内皮细胞所呈现的血管结构，以单色绿色或白色从多个角度展示。信号强度可能难以分辨，而伪彩着色则通过查找表提供图像强度信息，有助于更好地感知重叠结构的深度。

例如，此图展示了一个受精后六天的斑马鱼在发育完成后其血管系统的伪彩三维图像。该技术使我们能够探索淀粉样蛋白β在脊椎动物大脑中的血管效应。观看本视频后，您应能充分理解如何对胚胎期斑马鱼中的血管网络进行可视化，该模型系统为研究血管生成提供了经济且易于获取的实验平台。