Name: 신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용한 효모 단일 세포 시간 경과 영상 촬영 및 계보 추적 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동안 전사율 변화를 분석하여 유전자 발현 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 소프트웨어에 대한 의견을 에밀리 잭슨, 여호수아 Zeidman, 그리고 니콜라스 렌 감사합니다. 이 작품은 GM95733 (NM)로, BBBE 103316와 MIT 시작 기금 (NM까지)에 의해 재정 지원되었다.

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

위의 프로토콜은 마이크로 유체 또는 소프트웨어 개발에 대한 경험과 형광 시계열 데이터를 확보하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 하나의 단일 효모 세포의 시간 경과 형광 영화를 얻을 수 있습니다, 부목사 추적 및 계보 할당; 해당 셀 크기와 표현 측정을 추출하고 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 시간과 다양한 그래픽 사용자를 통해 전체 세포의 동작을 분석 인터페이스 (GUI). 실험, 분할 및 추적 단계는 다양한 방법으로 이전 11,13,14으로 접근하고 있지만, 위의 절차는 생물학 사회의 광범위한 집합에 이러한 기술에 더 쉽게 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 위의 절차가 특정 미세 배양 장치에 최적화되어 있지만, 전반적인 분석은 저렴하고 더 정의가 기성 미세 배양 기술로 유사한 장치에 적용 할 수 있습니다. fundam을entally, 우리는 고용 분할 및 지역 측정 알고리즘은 기존의 방법 13,14 비슷하지만 이식 소프트웨어는 시각적 영역 추적 및 계보...

유전자 발현의 단일 세포 분석은 유전자 조절의 여러 측면에 대한 우리의 이해를 발전한있다. 유동 세포 계측법 또는 현미경을 사용하여 형광 기자 표현식의 정적 스냅 샷은 단일 셀 표현의 분포에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 역사와 직접적으로 유전자 발현 역학을 통보하는 데 필요한 시간 시리즈 데이터의 진화를 부족합니다. 형광 시간 경과 현미경 단일 세포 측정 및 그들의 역사를 모두 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 다양한 실험 및 분석 기술은 따라서 이러한 휴대 전화의 변화 2,3, 세균 persister 형성 4, 전사 등의 유전자 조절 기능에 대한 통찰력을 (검토를 위해 1 참조) 부여, 형광 기자 식의 영화를 획득하고 정량화하기 위해 개발되었습니다 시작과 신장 5, 6,7 파열 전사, 세포주기 의존 8,9, 및 유전 10. 그러나 OBTaining 품질의 단일 세포 형광 시계열 배양에서 상당한 기술적 도전 제어 환경에서 획득 한 형광 영화의 높은 처리량 정량에있는 세포의 단일 층을 포함한다. 여기에, 우리는 S의 형광 영화를 획득하고 분석하는 절차를 설명 세포 배양 장치 제조 또는 소프트웨어 개발없이 필요한 경험 (그림 1) cerevisiae의. 첫째, 우리는 당신에게 세부 사항을 예를 들어 프로토콜을 하나 이상 형광 기자를 표현 신진 효모에 대한 형광 시계열 영화를 생성합니다. 사용자 정의 미세 배양 챔버를 구축하고 성공적으로 이전 11-13 사용되어 왔지만, 우리는 CellAsic (헤이워드, CA)에서 상업적으로 이용 가능한 미세 유체 장치를 사용하십시오. 시스템 경계 단층 성장 세포의 관류 환경을 지속적으로 제어 할 수 있습니다. 우리가 제시 현미경 프로토콜은 fluoresc를 얻을 수있는 간단한 방법입니다레퍼런스 신진 효모의 영화,하지만 수정 된 실험 프로토콜 (사용자 정의 문화 장치, 대안 미디어의 조건 등.) 단일 효모 세포의 유사 형광 동영상 데이터를 산출로 대체 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 시계열 데이터를 추출하는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반 MATLAB에서 소프트웨어 패키지 (매스 웍스, 틱, MA), 형광 시계열의 신속한 분석 (이식)에 대한 GUI 별명을 사용하여 영화의 분석을 설명 단일 세포. 이식 세포를 분할 및 추적과 형광 강도 및 형상 정보를 추출에서 다양한 오픈 소스 소프트웨어 패키지 셀 ID (14)와 유사한 기능을 가지고 있습니다. 그러나 이식은 중요한 추가 기능을 제공합니다. 첫째, 세분화 및 데이터의 정확성보다는 분석 후 국외자 지역 트레이스 단지 통계 게이트를 확인하기 위해 추적 결과를 쉽게 대화 형 편집을 제공합니다. 또한, 그것은 automaticall에 분석을 확장Y 지명 한 계보와 신진 효모의 관심의 세포주기를 가리 킵니다. 어머니와 딸은 두 개의 독립적 인 셀 영역을 형성하기 위하여 분할하는 경우 결정하는 전체 세포 (연결된 새싹을 포함한 어머니) 세포주기 8에 걸쳐 측정을 결정하는 매우 중요합니다. 제품군은 이러한 작업을 수행하기 위해 3 개의 모듈로 구성되어 있습니다. 집중과 산만 시야 이미지 사이의 대비를 기반으로하며 첫 번째 세그먼트 셀 영역은 사용자가 분할 매개 변수를 정의하고 시각적으로 테스트 할 수 있습니다. 초 (.에서 제공 블레어 크로커 등 IDL 루틴 듀프 레인의 MATLAB 구현을 사용하여 : 트랙 <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> )과 시간을 통해 셀 영역을 측정, 자동 계보를 할당하고, 육안 검사를 수 및 오류 수정. 간단한 플로팅 GUI는 쿼리를 단일 셀 속성에 포함되어 있습니다. 세 번째 모듈은 꽃 봉오리 출현과 분열 티타늄을 돌린다MES, 및 전체 세포의 시계열 데이터뿐만 아니라 그들의 첫 번째와 두 번째 시간 미분을 (같이 9에서 설명)를 출력합니다. 분석 모듈은 선택의 통계 소프트웨어의 후속 연구를위한 공백으로 구분 된 텍스트 파일로 데이터를 출력합니다. 따라서, 패키지는 사용자가 그래픽 인터페이스를 통해 높은 품질의 시계열 데이터를 추출 할 수 있습니다. 우리는 세포주기 9의 함수로 하나의 신진 효모 세포에서 실시간 녹음 속도를 추정하기 위해이 방법을 사용했습니다. 모듈이 싹 트는 효모, 매개 변수 또는 최적화되어 있지만, 필요한 경우, 자유롭게 사용할 코드는 다른 생물 및 이미지 유형에 적용 할 수 있습니다. 분할, 추적, 혈통 할당 알고리즘은 할당 된 이미징 및 문제 유기체의 유형에 해당 할 수 있습니다. 기존의 알고리즘은 대체하지만 여전히 사용자 친화적 인 육안 검사와 분할의 보정 변함 occu 추적 오류를 허용하는 GUI 인터페이스를 유지 할 수어떤 알고리즘 연구.

<table><tbody><tr><td>Y04C 효모 관류 플레이트</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX 미세유체 관류 플랫폼</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD 카메라</td><td>광량</td><td></td><td></td></tr><tr><td>루멘 200 메탈 할라이드 아크 램프</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼중 대역 통과 이색성 필터 큐브 및 여기 및 방출 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>세트 #89006</td><td>YFP(Venus/Citrine), CFP(Cerulean), RFP(mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 컨트롤러 및 필터 휠</td>에 사용 <td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>64비트 버전은 32비트보다 대용량 데이터 파일을 더 잘 처리합니다.</td></tr></tbody></table>

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

형광 시간 경과 현미경은 단일 세포 수준에서 많은 생물학적 과정의 연구에 강력한 도구가되고있다. 특히, 유전자 발현의 시간적 의존성을 묘사하는 영화는 규제의 역학에 대한 통찰력을 제공하지만, 단일 세포의 형광 영화를 획득하고 분석하는 많은 기술적 과제가있다. 우리는 여기에서 이러한 데이터를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 간단한 프로토콜 및 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반의 소프트웨어 패키지 형광 이미지를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 소프트웨어 세그먼트와 트랙 세포는, 사용자가 시각적으로 데이터의 오류를 부젓가락 할 수 있도록, 자동으로 혈통과 분열 시간을 지정합니다. GUI는 또한 전체 셀 추적뿐만 아니라 첫 번째와 두 번째 유도체를 생산하는 시계열을 분석합니다. 소프트웨어는 S.를 위해 설계되었습니다 동안 cerevisiae의 그 모듈과 다양성은 그것에게 t을 허용해야몇 가지 수정을 다른 세포 유형을 공부하는 플랫폼 역할을 O를.

성공적으로 수행하고 분석 실험은 현실적으로 할당 봉오리 출현과 분열 시간을 갖는 단일 전체 셀에 대한 대부분의 연속적인 시계열을 얻을 것입니다. 예를 들어, 우리는 성장과 글로벌 식 단세포 시간 (표 4, Y47에 다를 수 있습니다 방법을 관찰하기 위해 제정 ADH1 프로모터에 의해 구동 리안 형광 단백질의 통합 사본 (CFP)를 표현하는 반수체 효모 균주 위의 프로토콜을 수행 ). 우리는 시간이 지남에 따라 (그림 7A) 측정 전체 셀을 얻기 위해 시계열 분석을 실행하고, 9 발견 세포주기에 의존 볼륨과 표현 모두 나온다. 단백질 농도, 또는 평균 강도가 약간 (그림의 7B 및 7C) 감소하면서 봉오리 형성 한 후, 총 결합 된 볼륨 (어머니 + 새싹) (8,16와 일치) 더 빨리 봉오리 출현 이전보다 증가합니다. 결합 INTEGRA 상승테드 단백질 (이 경우 볼륨...

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

이 절차의 전반적인 목표는 성장하는 단일 효모 세포의 형광 영상을 얻고, 각 세포에 대한 리포터 발현 시계열 데이터를 추출하는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 챔버에서 세포 단층을 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 하나 이상의 리포터에 대해 타임랩스 형광 현미경 관찰을 수행하는 것입니다.다음으로, graft 소프트웨어 패키지를 사용하여 영상을 처리함으로써 시간에 따른 세포를 추적하고 측정합니다. 마지막 단계는 세포 측정값과 계통 할당을 분석하고, 각 전체 세포에 대한 리포터 발현 시계열 데이터를 내보내는 것입니다. 최종적으로, 발현 시계열로부터 추론된 순간 전사 속도를 통해 세포 주기 동안의 전사 변화와 전사 인자 수준 변화에 따른 전사 변화를 보여줍니다.이 방법은 활성 전사 인자의 갑작스러운 추가 또는 제거에 대해 서로 다른 프로모터가 얼마나 빠르게 반응하는지와 같이 유전자 조절 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 세포 집단 전반에서 이러한 반응은 얼마나 가변적이며, 형태 및 세포 주기 단계를 포함한 서로 다른 세포 특성이 반응에 어떤 영향을 미칩니까? 또한, 이 방법은 활성 전사 인자의 반복적인 추가 및 제거가 유전자 발현에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 마이크로플루이딕 장치에 로딩하기에 적합한 밀도로 영양분이 풍부한 정상 상태에서 성장시킨 효모 세포를 준비합니다. 그다음, Cell ASIC 사의 Y04C 마이크로플루이딕 배양 플레이트를 준비합니다. 운송 용액을 제거한 후 멸균수로 웰을 헹굽니다. Onyx perfusion system을 사용하여 1번부터 6번 웰까지 6 PSI로 5분 동안 물을 흘려 채널을 세척한 다음, 로딩 웰 8번부터 6 PSI로 10초 동안 흘려줍니다. 모든 웰에서 물을 제거하고, 유입 웰 1번부터 6번까지는 250 µL의 SC 배지로, 세포 로딩 웰에는 준비된 세포 배양액 50 µL로 교체합니다.Onyx 매니폴드를 플레이트에 밀봉한 후, Inlet Well 1번부터 6번까지 6 PSI의 압력으로 2분 동안 유체를 흘려 채널과 배양 챔버를 프라이밍합니다. 이어서 초기 배지가 담긴 inlet well에서만 최소 5분 동안 유체를 흘립니다. 현미경 단계 전까지 6 PSI로 이를 계속해서 흘려줍니다. 데이터 분석 시 세포 추적 성능을 향상시키기 위해, 실험 도중 플레이트가 움직이지 않도록 스테이지 마운트에 플레이트를 테이프로 고정합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 현미경 준비를 마친 후, 대물렌즈에 이머전 오일을 몇 방울 떨어뜨리고 미세유체 장치를 단단히 장착합니다.도립 현미경의 스테이지에서, 내장된 위치 마커 중 하나를 사용하여 첫 번째 배양 챔버의 왼쪽 3분의 1 지점에 초점을 맞춥니다. 배지 유입 웰의 흐름을 차단하고, 세포 로딩 웰 8번에서 6 PSI의 압력으로 5초 간격의 버스트 흐름을 가합니다. 스테이지를 이동하며 배양 챔버 주변의 세포를 탐색합니다.원하는 세포 밀도가 달성될 때까지 로딩 유속 시간과 압력을 높이되, 신선한 배지가 챔버로 유입되는 가장 왼쪽 배리어에 과부하가 걸리거나 막히지 않도록 주의하십시오. 시작 배지가 들어 있는 배지 입구 웰에서 6 PSI의 압력으로 유동을 시작하십시오. Metamorph 또는 기타 현미경 자동화 및 제어 소프트웨어에서 설정하십시오.시간 경과에 따라 여러 스테이지 위치에서 다수의 이미지를 촬영하도록 다차원 획득(multidimensional acquisition)을 설정하십시오. 타임 포인트의 수와 각 포인트 사이의 간격을 설정합니다. 그런 다음, 각각 약 10개의 세포가 포함된 여러 스테이지 위치를 선택하십시오.각 스테이지 위치와 각 시점마다 프로그램이 Metamorphs의 내장 오토포커스 방법을 사용하여 투과광 명시야 이미지에 초점을 맞추도록 획득 설정을 구성하며, 각 스테이지 시작 시 사용자 정의 저널로 오토포커스를 실행합니다. 위치 기반 설정은 초점 정확도에 대해 더 세밀한 제어를 제공합니다. 또한 프로그램이 초점 평면에서 +1 µm 지점에서 명시야 이미지를 획득하고, 초점 평면에서 -4 µm 지점에서 초점이 맞지 않은 명시야 이미지를 획득하도록 설정합니다.필요에 따라 이미지 간의 초점을 변경하려면 직접 작성한 저널을 사용하십시오. 마지막으로 프로그램을 설정하십시오. 초점면에서 각 형광 리포터에 대해 하나의 그레이스케일 이미지를 획득하십시오.광퇴색을 최소화하면서 신속하게 획득할 수 있도록 최적화된 설정을 사용하십시오. Onyx 제어 소프트웨어에서 실험을 위한 유체 흐름 프로그램을 준비하십시오. 그런 다음 Metamorph의 획득 프로그램과 Onyx 제어 소프트웨어의 유체 흐름 프로그램을 동시에 시작하십시오.MATLAB에서 format data M 파일을 실행하여 데이터 입력 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 엽니다. 상단에서 이미지 파일이 포함된 폴더를 지정하거나 찾아보기 하여 데이터 디렉토리를 설정한 다음, GUI를 사용하여 실험에서 기록된 데이터 유형과 이미지 파일을 지정합니다. 이어서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세그멘테이션 파라미터를 선택하십시오.명시야 이미지의 세그멘테이션을 위한 적절한 파라미터를 선택하는 것은 어려울 수 있으며, 이는 결과물인 시계열 데이터의 품질에 상당한 영향을 미칩니다. 본 연구에서는 모든 세포 영역을 식별하는 데 중점을 두며, 영역을 과소 세그멘테이션(under segmenting)하는 것보다 과다 세그멘테이션(over segmenting)하는 방향을 선호합니다. 시각적 데이터 검토 과정에서 과다 세그멘테이션된 영역은 서로 병합하여 전체 세포 영역을 형성할 수 있지만, 과소 세그멘테이션된 영역은 나중에 분리할 수 없기 때문입니다.다양한 세그멘테이션 파라미터를 설정한 후 'test Successfully'를 클릭하여 세그멘테이션 품질을 테스트하십시오. 세그멘테이션된 영역은 마젠타색 테두리가 있는 녹색으로 표시됩니다. 세그멘테이션 결과가 만족스러운 경우, 슬라이더를 사용하여 동영상의 여러 시점을 반드시 확인하십시오.분할 매개변수를 포맷 데이터 GUI로 되돌리려면 done을 선택하십시오. 본문에 설명된 대로 색상 매개변수를 선택한 후, auto threshold 버튼을 눌러 임계값을 자동으로 결정합니다. tzu's method를 사용하면 임계값 위에 보존된 영역이 이미지에 강조 표시됩니다.편집 상자를 사용하여 임계값을 수동으로 조정할 수 있습니다. 스크롤 바를 사용하여 모든 시점에 대해 임계값이 적절한지 확인하십시오. 설정이 완료되면 완료 버튼을 누르십시오.임계값을 format data GUI로 되돌리려면 add와 segment를 누르십시오. 컬러 마스크를 생성하려면 format data를 눌러 이미지 파일을 읽고, 데이터를 처리하여 지정된 폴더에 dot mat 파일을 생성하십시오. 이 파일은 process time series GUI의 입력값으로 사용됩니다.MATLAB에서 process time series M 파일을 실행하여 추적 GUI를 엽니다. GUI를 연 후, 먼저 챔버 높이를 설정하십시오. 이는 세포가 포획된 챔버의 높이를 나타냅니다.이는 세포 영역의 장축과 단축을 기반으로 세포 부피를 3D 타원체로 근사화할 때 제약 조건으로 사용됩니다. 그다음 픽셀당 마이크로미터 값을 설정하십시오. 이는 이미지의 픽셀 거리를 마이크로미터 단위로 보정하는 변환 계수로, 이를 통해 단면적과 부피를 각각 square micrometers 및 cubic micrometers 단위로 보정할 수 있습니다.다음으로, 필터 패널을 사용하여 최소 및 최대 매개변수를 설정함으로써 마스크의 불필요한 영역을 필터링합니다. Area는 픽셀 단위의 영역 면적입니다. ECC는 이심률 인자로, 값이 0에 가까울수록 더 원형에 가깝습니다.여기서 SF는 형상 계수(shape factor)이며, 이 값이 1에 가까울수록 더 원형에 가깝음을 의미합니다. 파일 입출력 패널에서 이미지들을 불러온 다음, format data GUI를 통해 출력된 관심 dot mat 데이터 파일을 선택하십시오. 각 컬러 채널에 영역 마스크(region mask)가 적용되며, 여러 가지 서로 다른 측정값이 산출됩니다. 그 후 텍스트에 설명된 대로 track cells 파라미터를 선택하여 데이터 파일을 저장합니다.트랙 셀을 클릭하여 영역 OID를 사용해 한 프레임에서 다음 프레임으로 영역을 추적하고, 새로 나타나는 싹에 계통을 할당하며 데이터를 저장하십시오. 필요한 경우 팝업 창에서 매개변수를 변경하십시오. 계통은 각 프레임에서 추정 싹과 잠재적 모체 사이의 거리를 최소화하여 자동으로 할당됩니다.선택된 세포 정보 패널 위의 버튼을 클릭하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 다양한 gooey 도구 또는 단축키를 사용하여 잘못 분할된 영역이나 ID 및 계보 할당의 오류를 교정함으로써 데이터를 적절히 큐레이션하십시오. 과분할된 영역은 병합하고, 세포 전체를 포착하지 못한 영역은 삭제하며, 모세포와 출아 세포(mother bud) 관계가 적절하게 할당되었는지 확인하십시오. 또한, 영역 병합을 통해 녹색 ID를 모두 제거하십시오.ID를 수정하고, 해당 영역을 모체에 할당하거나, 모체를 할당하지 않거나, 또는 영역을 삭제합니다. 최종 분석 단계에서 싹(bud) 데이터가 모체 데이터에 합산될 것이므로, 싹 영역을 모체 영역과 병합하지 마십시오.관심 있는 마지막 시점까지 각 프레임의 데이터를 시각적으로 검사하십시오. 전체 시계열 데이터를 모두 검사할 필요는 없습니다. 후반부 프레임을 사용하지 않는 경우, 모든 형광 채널에 대해 관심 시간 범위 동안 모든 세포 영역을 검사하고 시간에 따른 변화 양상이 출력 준비되었는지 확인한 후 반드시 변경 사항을 저장하십시오.전체 세포의 시간에 따른 시계열을 분석하기 위해 시계열 분석(time series analysis)을 실행하십시오. 세포 주기 정보를 계산하고 미분값을 구합니다. 관심 측정 항목을 선택하고 분석 매개변수를 입력할 수 있는 창이 열립니다. GUI에서 정리된 마지막 시점을 입력하십시오.기본 평활화 및 세포 주기 할당 매개변수는 5분 간격으로 촬영된 반수체 및 이배체 균주에 잘 작동하지만, 최적의 결과를 얻으려면 이를 조정해야 할 수도 있습니다. 모든 매개변수를 설정한 후, 분석(analyze)을 선택하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 세포 시계열 데이터를 내보내십시오. 성공적으로 수행 및 분석된 실험에서는, 구성적 DH1 프로모터에 의해 구동되는 통합된 CFP 또는 GFP 형광 단백질 복제본을 발현하는 halo 효모 균주에 대해, 현실적으로 할당된 출현 및 분열 시간을 가진 단일 전세포의 대부분 연속적인 시계열 결과가 도출될 것입니다. 시간 경과에 따른 전세포 측정값은 시계열 분석을 통해 얻었습니다.명시야 이미지는 분할된 모세포를 파란색으로, 출아된 세포를 녹색으로 보여줍니다. 전체 세포의 연속적인 외곽선이 빨간색으로 표시되어 있으며, 부피와 발현 모두 세포 주기에 의존함이 나타납니다. 여기서 빗금 친 영역은 세포가 G2 M기에 있고 출아가 일어나는 시점을 나타내며, 흰색에서 회색으로 변하는 부분은 G1에서 S기로의 전이 시점에 출아가 시작됨을 나타냅니다.음영 처리는 출아 형성 이후 회색에서 흰색 음영으로 변하는 M기에서 G1기 전이 단계의 세포 분열 시점에 이루어집니다. 전체 결합 부피는 이전보다 더 빠르게 증가하지만, 단백질 농도나 평균 강도는 약간 감소하는 동안 출아가 나타납니다. 결합 통합 단백질의 상승 또한 모세포 영역만으로 비교했을 때 출아 이후에 더 가속화됩니다.이러한 결과는 전체 세포 측정 시 출아(bud)의 기여분을 적절히 통합하는 것이 중요하다는 점을 입증하며, 적절한 출아 형성 및 분열 시간 할당의 필요성을 강조합니다. 세분화된 시계열 데이터는 순간적인 상대적 mRNA 수준과 전사 속도를 계산하는 데 사용될 수 있으며, 이 두 수치 모두 출아 후에 증가하여 안정적인 시간 생성 능력을 보여줍니다. 측정 시계열의 도함수는 텍스트 프로토콜에 기술된 전환 가능 발현 시스템을 이용한 역학 연구에도 도움이 됩니다.시계열 분석을 통해 전사 인자가 핵으로 국소화되는 시점과 표적 유전자의 전사가 시작되고 종료되는 시점을 확인할 수 있습니다. 여기에 제시된 전사 과정은 switchable YFP가 융합된 PHO four Tet R 트랜스 활성제(trans activator)를 가진 세포에 대해 지정된 4개의 획득 채널에서 촬영한 현미경 사진입니다. 트랜스 활성제는 낮은 인산염 농도에 반응하여 RFP로 표시된 핵으로 국소화되며, 7X Tet O 프로모터 CFP 리포터의 발현을 유도합니다.추론된 전사 속도는 평균적으로 그리고 단일 세포 수준에서 국소화에 따라 변화합니다. 이 절차를 거친 후, 발현이 시간에 따라 집단 전체에서 어떻게 변하는가? 외적 변동의 영향이 여러 세대에 걸쳐 유전되는가? 등 추가적인 질문에 답하기 위해 단일 세포 다차원 시계열 데이터에 대한 다른 분석들을 수행할 수 있습니다.재활성화 시 유전자 활성화 역학이 변화하는가? 세포 주기(cell cycle)가 역할을 하는가? 이 외에도 단일 세포의 유전자 발현 성장 및 계보 궤적 분석을 통해 해결해야 할 많은 질문들이 있습니다.

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연구

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생물학

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을...

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

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