Name: 불활성 가스 제트를 사용하여 붙음 세포의 Permeabilization (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 불활성 가스 제트를 이용한 붙음 세포 투과화 방법으로 유전물질과 생분자를 효율적으로 전달하세요. 이 기술은 세포생물학 및 유전공학 연구에 활용됩니다.

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건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) : 저자는 다음과 같은 자금 조달에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. LabVIEW 프로그램의 개발 <ol><li> 유량 제어기 (MKS M100B 매스 플로 컨트롤러) 정확한 가스 유량을 보장하기 위해 헬륨 가스 라인에 부착된다. 이 장치는 0과 5 V. LabVIEW 프로그램의 제어 루프는 임의의 주어진 시간에 필요한 전압을 결정 사이의 범위, 입력 전압에 의해 제어된다. 컴퓨터와의 사이에 인터페이싱 유량 제어기는 데이터 수집 장치 (NI의 USB-6009)에 의해 수행되고, 12 V 전원 공급 유량 제어기에 전원을 제공한다. </li><li> 두 개의 위치 선형 슬라이드는 6 - 웰 플레이트, 각 방향에 대해 하나의 움직임을 제어하기 위해 사용된다. 각 어셈블리는 스테핑 모터와 결합 된 MA15 시리즈 Velmex Unislide 어셈블리로 구성, 두 어셈블리는 모터 컨트롤러 스테핑 하나 Velmex VXM에 의해 제어된다. 제어기는 각각의 모터의 설명서 조깅 허용 또는 외부 시리얼 명령 문자열을 사용할 수의 조합은 특정 움직임을 허용 Patterns. 여러 패턴만을 원하는 토치 속도뿐만 아니라 경로 치수를 제공하기 위해 사용자가 요구하는 LabVIEW 프로그램으로 프로그래밍 될 수있다. </li></ol> 2. 장비의 제조 <ol><li> 헬륨 실린더와 레귤레이터를 모두 엽니 다. </li><li> 모터 컨트롤러의 전원을 켭니다. </li><li> LabVIEW 프로그램을 열고 모든 조건을 확인합니다. </li><li> 플랫폼이 중심이되어 있는지 확인합니다. 확인 각 모터의 단계에서 보면 각 캐리지가 무대 한쪽 끝 근처에 있지 않은지 확인합니다. 프로그램 중심 캐리지 있고 또는 수동으로 모터 제어기의 전면에 조깅 컨트롤을 사용하여 조정하거나. </li><li> 이 날의 첫 번째 실행 인 경우에는 설치 프로그램이 제대로 작동 할 수 있도록, 세포없이 한 번 프로그램을 실행하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 가스 제트 모세관 노즐 높이의 준비 <ol><li> 홀더에서 모세 혈관을 제거하고 높이 다이얼을 제로. </li><li> 6 잘 플레이트 (을)를 배치N 플랫폼. </li><li> 교체하여 커버 슬립을 돌 때까지 우물의 바닥에 가스 제트 모세관을 낮 춥니 다. 홀더에 모세관을 고정합니다. </li><li> 높이 다이얼을 사용하여 모세관 3mm를 올립니다. 모세관베이스에서이 높이를 표시합니다. </li><li> 안전한 높이로 모세 혈관을 마련하고 6 잘 플레이트를 제거합니다. </li></ol> 4. 셀 Permeabilization 프로토콜 <ol><li> 커버 유리에 합류하는 농경 점착성 세포주는 표준 배양 기술을 사용하여 6 - 웰 플레이트에 미끄러진다. HeLa 세포의 경우, 씨앗 6 - 웰 웰 당 2 × 10 5 세포와 접시와는 치료 전 48 시간 동안 배양한다. </li><li> 원하는 벡터를 함유 용액의 적절한 볼륨을 준비합니다. hrGFPII-1, 1X PBS에서 50 NG / μL의 농도는 HeLa 세포에서 강한 형광 신호 형질 전환 후 24 시간을 제공하십시오. 덱스 트란 연구의 경우, 10 kDa의 녹색 형광 덱스 트란 80 ㎍ / ml를 추천합니다. 금후,이 용액을 칭한다의 &quot;벡터 솔루션&quot;. </li><li> 우물에서 세포 배양 배지를 제거하고 1X PBS로 3 회 씻어. </li><li> 우물에 4.2 단계에서 제조 된 벡터 솔루션의 1,370 μl를 피펫. 이 약 1.3 mm의 액체 깊이에서 발생한다. </li><li> 플랫폼의 중심에있는 벡터를 함유하는 용액을 잘 배치. 슬라이드 위에 3mm의 노즐 높이를 나타내는 이전에 표시된 수준으로 가스 분사 노즐을 낮추. </li><li> LabVIEW 프로그램에서 헬륨 유량을 설정하고 사용하기 원하는 움직임 패턴을 선택한다. 때 permeabilization 프로토콜을 시작할 준비가 &quot;실행&quot;을 선택합니다. 유량 제어기는 필요한 유량을 제공하기 위해 준비하는 동안 초기 지연 기간이있을 것이다. 적절한 유동 속도에 도달하면, LabVIEW 프로그램은 원하는 permeabilization 패턴에 잘 이동할 스테퍼 모터를 활성화 할 것이다. 플랫폼이 정지되면, 약 30 초를 기다려 벡터 솔루션을 제거합니다.참고 : 최적 permeabilization는 모세관의 직경에 따라, 노즐 출구에서 100 ~ 200 ㎩하에 동압 근처에 발생한다. </li><li> 1X PBS로 잘 세 번 씻으십시오. </li><li> 신선한 문화 매체와 잘 기입하십시오. </li><li> 실험의 원하는 번호를 4.6 - 반복 4.3 단계를 반복합니다. 참고 : 그들을 통해 실행되는 가스 제트없이 벡터 솔루션을 충만 우물로 구성 제어 샘플을 포함해야합니다. 다음 단계를 4.5과 4.6로 진행 약 1 분간 제어 우물에 솔루션을 둡니다. </li><li> hrGFP 형질 전환 실험을 실행하는 경우, 형질 전환 물질이 세포에 의해 복사 할 수 있도록 24 시간 동안 인큐베이터 6 - 웰 플레이트를 반환합니다. 덱스 트란 permeabilization 실험을 실행하면, 15 분 동안 인큐베이터 6 잘 플레이트를 반환합니다. </li></ol> 5. 셀 이미징 <ol><li> 원하는 경우, 직전 이미징, 세포 죽음을 평가하는 적절한 죽은 / 라이브 얼룩 counterstain. </li><li> approp와 이미지 세포형질 전환 / permeabilization 효능을 조사하기 riate 현미경. </li></ol>

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<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.

불활성 가스 제트 permeabilization은 자기편 세포의 형질 전환을위한 유용한 기술이다. 그것은 잠재적으로 유해한 화학 물질이나 바이러스 벡터에 대한 필요성을 없애 기계적 힘의 용도로 세포에 생물 분자를 전송하는 기능을 제공한다. 이 기술은 잠재적으로 연구자와 임상의에게 정확하게 세포를 형질 효율적이고 비교적 간단한 방법을 제공 할 수 있습니다. permeabilization의 선택은 또한 연구자는 여러 응용 프로그램에 유용 할 수있는 하나의 식민지에있는 특정 세포를 취급 할 수 있도록 고유합니다. 몇개의 파라미터는 모세관 노즐 직경 및 각도, 가스 유량, 액체 및 모세관 신장 세포주, 사용되는 표적 생체 분자와 불활성 가스의 종류 등의 개별 실험을 위해 조정될 수있다. 세트 액위 모세관 높이는 절차에 설명되어 있고이 값은 우리 experime에 관련된 변수의 개수를 최소화하기 위해 선택되었다국세청. 현재, 우리는 실험적인 유동 가시화 및 전산 유체 역학을 사용하여 ...

생물 의약의 발전과 세포 역학의 이해, 세포로 생체 분자의 전달은 많은 연구 분야 및 의료 치료에 중요한되고있다. 다른 기술은 세포막을 통해 세포의 세포질에 외래 분자를 도입하기 위해 개발되었다. 바이러스, 화학 또는 기계적 방법 : 이들은 일반적으로 분류 될 수있다. 바이러스 성 기술은 바이러스 벡터를 사용하여 RNA 및 DNA로 유전 물질을 형질있다. 바이러스 성 기술은 그러나 그들은 면역 및 염증 반응 2에 대한 가능성을 가지고 할, 특정 세포 라인에 높은 효율을 가지고하는 경향이있다. 일반 화학 형질 전환 방법은 인산 칼슘 3, 세균 외독소 4 리포 펙 (5)과 강수량 (가) 있습니다. 이러한 기법은 효과적 일 수있다, 그러나, 특정 문제는 세포 독성 및 비 특이성으로 발생한다. 또한, 칼슘 인산염 같은 기법전자 강수량은 거의 일차 전지 6에서 최대 70 %에 있지만, 특정 세포주에 형질 전환 효율이 발견되었습니다. 증가하는 연구 노력은 특히 임상과 DNA의 기능에 대한 연구를위한 다양한 치료를 설계하는 경우, 일차 전지에 투입되는 등이 주입니다. 기계적 자극을 통해 세포막의 일시적인 중단이 세포로 외래 분자를 도입하기위한 대안이다. 기술은 다음을 포함한다 : 분자 (7)의 미세 주입, 막 8,9을 방해하는 전기장을 사용하여 일렉트로, sonoporation와 결합 입자를 촬영 &quot;유전자 총&quot;에 의해 설명되는 것과 같이 세포막 10-12, 입자 충격을 방해하기 위해 초음파를 사용하여 셀 (13) 내로의 유전자, 및 더 최근에, 시간적으로 포유 동물 세포에게 14,15 투과 표시되었습니다 유체 전단 응력의 ​​적용. 하지만 정비공알 방법은 앞서 언급 한 몇 가지 문제를 방지, 그들은 일반적으로 낮은 효율성과 매우 복잡하고 전문적인 설정 함께 제공됩니다. 대기압 글로우 방전 토치 (APGD-t)는 표면 기능화 및 생체 외 (16)에 부착 세포를 분리의 초기 목표로 맥길로 개발되었다. Serendipitously, 사용되는 라이브 / 죽은 얼룩은 어떻게 든 permeabilizing 에이전트가 첨가하지 않고 세포에 의해 촬영되고 있음을 발견했다. 또한,이 단지 토치 경로와 일치하는 일이 우물의 제한 지역에서 발생한 것 같았다. APGD-T의 permeabilization 기능의 조사는 계속 제어 연구에서, 그것은 여자가없는 플라즈마의 캐리어 불활성 가스 제트는 또한 세포를 투과 할 수 있었다 것으로 나타났습니다. 이것은 플라즈마 제트에 의해 생성 된 반응 종 일시적 막의 기능을 손상 초기 가설 모순 및 제안 단순히 기계적 것을칼의 힘은 세포 permeabilization의 원인이하기에 충분했다. 여기에서 연구를 시도하고 정량화 permeabilization의 불활성 가스 제트의 효율성뿐만 아니라 형질 전환 기능 (16)에 의해 모양의 특징을 우리의 실험실에서 계속했다. 이러한 연구를 통해, 그 미세 기공은 세포막에 팩트 형태로 수행하는 것이 발견되었으며, 이러한 기공은 약 5 초 이내에 15 봉인하는 경향이있다. 우리는 병아리 태아의 융모 막 생체 외 및 생체 내에서 기술의 유틸리티를 증명하고있다.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td> HeLa 세포 Dextran, AlexaFluor 488<td>에 대한 형질 주입 실험을 위한 녹색 형광 단백질</td></tr><tr><td>; 10,000MW, 음이온성, Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>투과화 실험을 위한</td> <td>D22910</td> 덱스트란</tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>포유류 세포의 반대 염색을 위한</td> <td>L3224</td></tr>: 금 퇴색 방지 시약 연장, 초고순도 헬륨 Praxair Canada Inc<tr><td></td>.<td>를 이미징할 때 슬라이드를 장착하기 위한</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ 고포도당 미디어 - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>HeLa 세포용</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>DMEM 매체용</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, 액체</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>DMEM 매체용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>실험실에서 생산</td></tr><tr><td>됨&nbsp;</td><td></td><td></td><td>표 1. 필요한 시약 목록</td></tr><tr><td>6-Well Clear TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 커버슬립</td><td>피셔</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI 사이징 정보</td></tr><tr><td>ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 주문 #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass-Flo 컨트롤러</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>질량 흐름 컨트롤러, 시리즈 M100B, 외부 12 V 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>필요 USB-6009 DAQ 장치</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스테핑 모터 및 컨트롤러가 있는 UniSlide 어셈블리</td><td>Velmex</td><td></td><td>두 시리즈 MA15 UniSlide 어셈블리, Vexta 1.8&deg; Velmex에서 제공하는 스테핑 모터, VXM 스테핑 모터 컨트롤러로 제어</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>표 2. 필요한 장비 목록</td></tr></tbody></table>

불활성 가스 제트를 사용하여 붙음 세포의 permeabilization

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

다양한 세포 형질 전환 기술이 존재하고 이러한 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다 바이러스, 화학, 기계. 이 프로토콜은 시간적으로 세포 내로 일반적으로 비 투과성 거대 분자의 전달을 용이하게 할 수있는 불활성 가스 제트를 사용하여 접착 세포를 투과하는 기계적 방법을 설명한다. 우리는이 기술의 미세 임시 형성의 결과로, 부착 세포의 원형질막에 전단력을 부여하여 작동 믿는다. 이러한 기공이 생성되면, 세포는 유전 물질 및 기타 생체 분자 투과성이다. 관련된 기계적 힘은 기판에서 영구적으로 손상 또는 분리 세포의 위험을 실행 않습니다. 기술이 효과가 불활성 기체 역학의 좁은 범위, 따라서이있다. 불활성 가스 제트는 헬라, HEK293 인간의 복부 대동맥 내피 세포를 포함한 다양한 자기편 세포 라인을 permeabilizing에 효율적으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 P에 적합한우리가 미래의 임상 응용 프로그램에서 잠재적으로 연구에 사용될 수있다 표시, 생체 내에서 증명하고있다으로 관내에는 양쪽 모두에서 부착 세포의 ermeabilization. 또한 가치있는 연구 도구가 될 증명할 수있는, 공간적으로 제한적인 방법으로 세포를 permeabilizing의 장점이 있습니다.

0.86 mm의 내경을 가진 모세관 헬륨 가스 제트를 사용하여 10 kDa의 녹색 형광 덱스 트란과 함께 HeLa 세포의 Permeabilization도 1에 도시된다. 세포는 즉시 세포 죽음을 시각화하는 2 μL / ㎖의 EthD-1 솔루션 (LIVE / DEAD 생존 / 세포 독성 키트)와 permeabilization 후 대조되었다. 즉시 counterstaining 다음, 커버 전표를 장착하고 몇 군데 있었다. 이 그림은 대조 시료에 비해 세 가지 다른 출구 압력에서 헬륨 가스 제트를 실행의 결과를 보여줍니다. permeabilization 트랙 폭과 효율성은 약간 증가 (A와 B)를 보여 높은 동적 압력과 세포 죽음으로 증가합니다. 높은 동적 압력에 도달했다 그러나, 일단, 헬라 세포는 커버 전표에서 제거하고 약간의 주변 permeabilization가 발생했다. 세포 형질 감염 및 스트리핑 효율의 더 상세한 분석 기계 추이 나드 의해 실시되었다펠레 ...

이 프로토콜은 불활성 가스 제트를 이용한 부착 세포의 임시 permeabilization위한 방법을 설명한다. 이 방법은 세포막을 방해하는 기계적 힘의 이용에 의한 부착 성 포유 동물 세포에 유전 물질과 생체 분자의 전달을 용이하게한다.

불활성 가스 제트를 사용하여 붙음 세포의 Permeabilization

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

이 절차의 전체적인 목표는 부착 세포를 투과성 있게 만드는 것입니다. 이는 먼저 6-웰 플레이트의 커버슬립 상에서 실험 세포를 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 1XPBS로 세포를 헹구고, 세포 내부로 전달할 생체 분자가 포함된 용액으로 세포를 덮는 것입니다.다음으로, 비활성 기체 제트를 분사합니다. 샘플은 세포를 투과합니다. 마지막 단계는 필요에 따라 세포를 고정하고 염색하는 것입니다.최종적으로, 투과 효율과 세포 생존율을 확인하기 위해 면역형광 현미경법을 사용합니다. 증식법이나 유전자 총(gene gun)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 설정이 간편하며, 부착 세포의 공간적으로 제한된 투과가 가능하다는 점입니다. 배양 과정에서 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자는 특정 응용 분야에서 효율적인 투과를 가능하게 하는 가스 유량이나 모세관 직경과 같은 특정 파라미터를 최적화하는 데 시간이 걸려 어려움을 겪을 수 있습니다.본 절차에 사용되는 질량 유량 제어기(mass flow controller)는 외부 12 vol 전원 공급 장치가 필요하며, 정밀한 가스 유량 속도를 보장하기 위해 헬륨 가스 라인에 연결됩니다. 질량 유량 제어기와 컴퓨터 간의 인터페이스는 데이터 수집 장치에 의해 수행됩니다. 이 장치는 0에서 5 volt 사이의 입력 전압으로 제어됩니다. LabVIEW 프로그램의 제어 루프가 특정 시점에 필요한 전압을 결정합니다.6-well 플레이트의 이동을 제어하기 위해 각 방향으로 하나씩, 두 개의 포지셔닝 리니어 슬라이드가 사용됩니다. 각 어셈블리는 스테핑 모터와 결합된 MA 15 시리즈 Velm X uni 슬라이드 어셈블리로 구성되며, 두 어셈블리 모두 단일 VELM XVXM 스테핑 모터 컨트롤러에 의해 제어됩니다. 이 컨트롤러를 통해 각 모터를 수동으로 조그(jogging)하거나 외부 시리얼 명령 문자열을 입력할 수 있습니다.이러한 조합을 통해 특정한 이동 패턴을 구현할 수 있습니다. LabVIEW 프로그램에는 여러 패턴을 프로그래밍할 수 있어, 사용자는 원하는 토치 속도와 경로 치수만 입력하면 됩니다. 헬륨 실린더와 레귤레이터를 모두 열고 모터 컨트롤러를 켜서 장비 준비를 시작하십시오.LabVIEW 프로그램을 실행하고 모든 조건을 확인하십시오. 다음으로, 점검을 위해 플랫폼이 중앙에 위치해 있는지 확인하십시오. 각 모터 스테이지를 살펴보고 각 캐리지가 스테이지 양 끝단에 근접하지 않았는지 확인한 후, 프로그램을 통해 캐리지를 중앙으로 이동시키십시오.하루 중 처음으로 사용하는 경우, 설정이 올바르게 작동하는지 확인하기 위해 세포 없이 프로그램을 한 번 실행하는 것이 좋습니다. gas Jett 모세관 노즐 높이를 준비하려면, 홀더에서 모세관을 제거하고 높이 다이얼을 0으로 맞추십시오. 6웰 플레이트를 플랫폼 위에 놓으십시오.가스 제트 모세관을 교체하고, 커버슬립에 닿을 때까지 웰 바닥으로 내립니다. 높이 조절 다이얼을 사용하여 홀더에 모세관을 고정합니다. 모세관을 3 mm 올린 후, 모세관 베이스에 이 높이를 표시합니다.마지막으로, 모세관을 안전한 높이까지 올린 다음 6-웰 플레이트를 제거합니다. 본 프로토콜에 사용되는 부착성 세포주는 HeLa 세포의 표준 배양 기술을 사용하여 6-웰 플레이트 내의 유리 커버슬립 위에서 컨플루언스(confluence) 상태가 될 때까지 배양해야 합니다. 웰당 2 × 10⁵개의 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 처리 전 48시간 동안 배양합니다.처치 당일에 원하는 벡터가 포함된 적정 부피의 용액을 준비합니다. 덱스트린 연구의 경우, 이후부터는 10 kilodalton 녹색 형광 덱스트린 80 micrograms per milliliter 농도를 권장합니다. 이 용액을 벡터 용액이라고 합니다.웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 XPBS로 세 번 헹군 후, 벡터 용액 370 microliters를 웰에 분주합니다. 이때 액체 깊이는 약 1.3 millimeters가 되어야 합니다. 벡터 용액이 담긴 웰을 플랫폼 중앙에 배치합니다.가스 제트 노즐을 슬라이드 위 3 mm 높이를 나타내도록 이전에 표시한 수준까지 내립니다. LabVIEW 프로그램에서 헬륨 유량을 설정하고 사용할 이동 패턴을 선택합니다. 실행(run)을 선택합니다.투과 프로토콜을 시작할 준비가 되면, 질량 유량 제어기가 필요한 유량을 제공하기 위해 준비하는 초기 지연 시간이 발생합니다. 이 프로토콜의 성공을 위해서는 세포 층의 깊이를 최소화하고 세포 박리를 방지하기 위해 유량 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. 적절한 유량에 도달하면 LabVIEW 프로그램이 스테퍼 모터를 작동시켜 웰을 원하는 투과 패턴으로 이동시킵니다. 플랫폼이 정지하면 플랫폼에서 6-웰 플레이트를 제거하십시오.약 30초 동안 기다린 후 벡터 용액을 제거합니다. PBS로 웰을 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 웰에 신선한 배양액을 채웁니다.원하는 실험 횟수만큼 투과 프로토콜을 반복하십시오. 가스 제트를 분사하지 않고 벡터 용액만 채운 웰로 구성된 대조군 샘플을 반드시 포함하십시오. 대조군 웰의 용액은 제거 전 약 1분 동안 그대로 둡니다.PBS로 세포를 세척하고 웰에 신선한 배양액을 채웁니다. 6-웰 플레이트를 인큐베이터로 옮기며, 덱스트린 투과성의 경우 15분 동안 배양합니다. 그 후, 적절한 현미경으로 세포 이미지를 촬영하여 투과 효율을 조사합니다.여기 제시된 결과는 내경 0.86 millimeter 헬륨 가스 제트를 사용하여 10 kilodalton 녹색 형광 덱스트린으로 HeLa 세포의 투과성을 확인한 것입니다. 모세혈관 패널 A, B, C는 세 가지 서로 다른 출구 압력에서 헬륨 가스 제트를 작동시킨 결과이며, 패널 D는 덱스트린을 첨가하였으나 헬륨 가스 제트에 노출시키지 않은 대조군입니다. 세포 사멸을 시각화하기 위해 투과 처리 직후 세포를 대조 염색하였습니다. 이 이미지에서 덱스트린은 녹색으로 형광을 띠며, 사멸한 세포는 적색으로 형광을 띱니다.패널 A와 B에서 동압이 높을수록 세포 사멸의 증가는 미미한 반면, 투과 트랙의 너비와 효율은 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그러나 패널 C에서 관찰된 바와 같이 높은 동압에 도달하자, HeLa 세포가 커버슬립에서 떨어져 나갔으며 주사 전자 현미경 연구를 통해 주변부 투과가 거의 일어나지 않았음을 확인했습니다. 세포막에서는 미세공이 관찰되었습니다.이 예시에서는 내경 0.86 millimeter 모세관과 300 Pascals의 출구 압력을 갖는 헬륨 가스 제트를 사용하여 HeLa 세포의 투과화를 수행하였으며, 50,000 x 배율의 주사 전자 현미경 이미지를 획득하였습니다. 패널 A는 매끄러운 세포 표면을 보이는 대조군 샘플을 나타내며, 패널 B는 직경 84 nanometer의 기공이 나타나는 투과된 세포의 표면을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 15분에서 30분 정도 소요됩니다. 절차를 마친 후, 세포 생존율과 같은 추가 요인을 평가하기 위해 염색을 수행할 수 있습니다.

permeabilization-of-adhered-cells-using-an-inert-gas-jet

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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불활성 가스 제트를 사용하여 붙음 세포의 Permeabilization

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