在FDA批准的Vero细胞疫苗开发产生重组沙粒

该程序的总体目标是展示一种简单且高度可重复的方案，用于在 FDA 批准的 Vero 细胞中生成重组沙粒病毒，用于潜在的疫苗或疫苗载体种子开发。这是通过首先仔细制备质粒 DNA 转染混合物来实现的。第二步是用质粒 DNA 转染混合物转染 Vero 细胞。

接下来，有必要将转染细胞放大到 100 毫米培养皿中。最终，最后一步是使用野生型病毒或双荧光显微镜进行免疫荧光检查，并使用 tris 分段病毒进行 GIA 荧光素酶表达，与现有方法（如拯救和 rine 细胞系）相比，确认病毒拯救成功。该方案在 Vero 细胞中产生肾病毒，这些病毒已被 FDA 批准用于疫苗的开发。

除了产生潜在的疫苗种子外，已报道的表达三节段病毒的基因也可用于在头部通量筛选中鉴定针对 VIR 的抗病毒药物，而无需进行病毒检测的二次测定。首先，制备 250 μL 最佳培养基，根据病毒，每次转染挽救 10 至 12 μg lipo 2000，在室温下孵育 5 至 10 分钟。在此期间，使用每种病毒挽救的推荐量，在单独的微量离心管中制备血浆转染混合物。

将最终体积最佳化至 50 μL。接下来，将 250 μL 最佳脂肪混合物加入血浆 DNA 转染混合物中，并在室温下孵育 20 分钟。为了制备 Vero 细胞，首先平衡，将 P-B-S-D-M-E-M 10%FBS 1%PS 培养基和胰蛋白酶 EDTA 混合物至 37 摄氏度以收获细胞局，用 5 毫升 PBS 洗涤培养物两次。

然后如有必要，加入 1 毫升胰蛋白酶 EDTA 用于细胞分离，轻轻敲击以完全分离细胞。现在将细胞重新悬浮在 15 mL离心管中的 10 mL完整DMEM中。然后以 1000 RPM 的速度离心细胞 5 分钟，重新将细胞悬浮在 10 mL 完全 DMEM 中。

对细胞进行计数，并将浓度调整为每毫升 6 个细胞的 10 倍。在室温孵育 20 至 30 分钟后，将 1 毫升 Vero 细胞加入最佳 lemine、DNA 质粒混合物中，并在室温下孵育 5 分钟。现在将 lipo DNA 细胞混合物接种到 6 个孔板中。

轻轻摇晃，然后放入培养箱中。转染后 16 至 24 小时，去除转染培养基并加入 2 mL 感染培养基培养物，使细胞再培养 48 小时。接下来，细胞去除组织培养上清液，用一个 XPBS 洗涤两次，胰蛋白酶如前所述冰敷细胞。

然后将细胞重悬于 1 mL 完整 DMEM 中，使细胞沉淀，离心 5 分钟。在 5， 000 RPM 和 4 摄氏度时。小心地将沉淀重悬于 1 毫升感染培养基中，并将细胞转移到 100 毫米培养皿中。

使用感染性培养基，将板中的总体积增加到 8 毫升，该体积足以防止细胞干燥以及浓缩病毒。培养后轻轻摇动 100 毫米培养皿，以获得均匀的单层转染细胞。72 小时后，收集组织培养上清液离心以去除细胞碎片，并在滴定前一天将上清液储存在零下 80 摄氏度。

用 PBS 和胰蛋白酶冰洗涤 Vero 细胞两次。复苏后，将细胞悬浮在 10 毫升完全 DMEM 中。用血细胞计数器计数细胞，并将浓度调整为每孔 4 个细胞的 10 的 4 倍，然后准备 96 孔板以达到 80% 至 90% 的 co fluness。

第二天。用手轻轻摇动板，以获得细胞的均匀分布。在感染当天将细胞培养过夜。

进行感染之前，在显微镜下检查细胞以确认单层细胞。现在连续稀释含有病毒的组织培养上清液，这些上清液在 96 孔板中以最佳方式回收，然后从接种的 Vero 细胞中吸出培养基。用 50 微升 PBS 洗涤两次，并用 50 微升连续稀释的病毒感染细胞。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下感染细胞一个半小时。接下来，以每孔 100 μL 感染培养基去除病毒接种物，并将细胞孵育 16 至 18 小时。现在从每个中取出组织培养上清液。

用 4% 甲醛（用 PBS 稀释）在室温下固定细胞 15 分钟。然后用 0.1% Trite X 100 在室温下去除甲醛和透酶 10 分钟。接下来，吸出渗透溶液，用 100 微升含 2.5% 牛白蛋白血清的 PBS 锁定细胞洗涤 3 次。

在 2.5% BSA 中稀释沙粒病毒蛋白特异性一抗，然后离心 15 分钟。以 3， 500 RPM 的速度，在 37 °C 下用适当的氟 4 偶联二抗洗涤 3 次 PBS 后，在 37 °C 下将细胞与抗体孵育 1 小时。去除二抗，用 100 μL PBS 洗涤 3 次。

接下来通过使用荧光显微镜计数荧光焦点形成单位进行滴定。与野生型重组沙粒病毒相似。首先连续稀释组织培养物中存在的病毒，上清液，然后在孵育 16 至 18 小时后，通过计数荧光聚焦滴定 Trio 分体病毒，上清液感染 96 孔板中的 Vero 细胞，使用荧光显微镜形成单位。

或者，在 96 孔白色板中使用 100 μL 组织培养上清液通过 Gaia 荧光素酶表达来测量病毒的成功拯救。根据制造商的建议设置光度计。向每个样品中加入 50 至 100 微升 Gaia 测定溶液。

然后用发光计作为阴性对照测量 Gaia 报告基因表达。测量野生型病毒感染细胞的 TCS 的 Gaia 表达。Arena 病毒是具有双分段基因组的包膜负链 RNA 病毒。

每个片段都使用 Ambi Sense 包被策略来指导两种病毒蛋白的合成。在相反的方向上，两种类型的拯救质粒用于在 Vero 细胞中产生重组沙粒病毒。PCA 的表达质粒指导病毒蛋白 L 和 np 的合成。

人聚合酶 1 质粒指导病毒 RNA 片段的合成。在 16 至 18 小时使用 IFA 检测病毒抗原可证实成功挽救重组野生型沙粒病毒。通过组织培养感染 Vero 细胞后，上清液细胞用 LCMV 或犬科动物 1 号特异性抗体染色。

在 tris 分段沙粒病毒拯救人聚合酶中，一个质粒在一个质粒中分离成两个质粒。NP 被 GFP 取代，在另一个质粒中，GP 被 Gaia 基因取代。成功的病毒拯救可以通过荧光显微镜观察 GFP 表达来简单地评估。

此外，可以通过评估 Gaia 表达来确认成功的救援。观看此视频后，您应该对如何在具有高重现性的 Vero 细胞中拯救野生型和 tris 分段的竞技区病毒有很好的了解。我们建议对每种推荐的病毒进行 3 次独立转染，以增加我们成功挽救的可能性，因为严重的细胞不容易转染。