Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein einfaches und hochgradig reproduzierbares Protokoll für die Erzeugung rekombinanter Arenaviren in von der FDA zugelassenen Vero-Zellen für die Entwicklung potenzieller Impfstoffe oder Impfstoffvektoren zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Plasmid-DNA-Transfektionsgemisch sorgfältig vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, Vero-Zellen mit dem Plasmid-DNA-Transfektionsgemisch zu transfizieren.

Als nächstes ist es notwendig, transfizierte Zellen in 100-Millimeter-Schalen zu skalieren. Letztendlich besteht der letzte Schritt darin, eine erfolgreiche Virusrettung durch Immunfluoreszenz mittels Wildtyp-Virus- oder Bi-Fluoreszenzmikroskopie und GIA-Luciferase-Expression mittels Tris-segmentiertem Virus im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Rescues und Rine-Zelllinien zu bestätigen. Dieses Protokoll erzeugt Nierenviren in Vero-Zellen, die von der FDA für die Entwicklung von Impfstoffen zugelassen sind.

Neben der Erzeugung von potenziellem Impfstoffsaatgut kann das berichtete Gen, das das trisegmentierte Virus exprimiert, auch zur Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen gegen VIRs in Kopfdurchsatz-Screenings eingesetzt werden, ohne dass sekundäre Assays für den Virusnachweis erforderlich sind. Bereiten Sie zunächst 250 Mikroliter des optimalen Mediums vor und inkubieren Sie je nach Virus 10 bis 12 Mikrogramm Lipo 2000 pro Transfektion fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während dieser Zeit die Plasmatransfektionsmischung in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit den für jede Virusrettung empfohlenen Mengen vor.

Bringen Sie das Endvolumen mit Optimum auf 50 Mikroliter. Anschließend mit 250 Mikrolitern des optimalen Lipo-Gemischs in das Plasma-DNA-Transfektionsgemisch geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um Vero-Zellen vorzubereiten, äquilibrieren sie zunächst das P-B-S-D-M-E-M 10%FBS 1%PS-Medium und das Trypsin-EDTA-Gemisch auf 37 Grad Celsius, um das Zellbüro zu ernten, waschen Sie die Kulturen zweimal mit fünf Millilitern PBS.

Fügen Sie dann bei Bedarf einen Milliliter Trypsin EDTA zur Zellablösung hinzu und klopfen Sie sanft ab, um die Zellen vollständig zu lösen. Nun werden die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen wieder suspendiert. Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 U/min und suspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM.

Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf eins mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter ein. Nach der 20- bis 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur geben Sie einen Milliliter Vero-Zellen in die optimale Lemin-DNA-Plasmid-Mischung und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Säen Sie nun die Lipo-DNA-Zellmischung in sechs Well-Platten.

Vorsichtig schütteln und dann in den Inkubator stellen. Nach 16 bis 24 Stunden, nach der Transfektion, entfernen Sie das Transfektionsmedium und fügen Sie zwei Milliliter Infektionsmedienkultur hinzu, die Zellen für weitere 48 Stunden. Neben der Passage entfernen die Zellen den Gewebekulturüberstand, waschen die Zellen zweimal mit einem XPBS und Trypsin kühlen die Zellen ein, wie zuvor gezeigt.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter vollständigem DMEM, um die Zellen fünf Minuten lang zu pelletieren. Bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Pellets vorsichtig in einem Milliliter Infektionsmedium und geben Sie die Zellen in eine 100-Millimeter-Schale.

Bei infektiösen Medien erhöhen Sie das Gesamtvolumen in der Platte auf acht Milliliter, ein ausreichendes Volumen, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern und das Virus zu konzentrieren. Schütteln Sie die 100-Millimeter-Schale vorsichtig, um nach der Kultur eine gleichmäßige Monoschicht aus transfizierten Zellen zu erhalten. Nach 72 Stunden sammeln Sie die Gewebekulturüberstände, zentrifugieren Sie, um die Zelltrümmer zu entfernen, und lagern Sie die Überstände am Tag vor der Titration bei minus 80 Grad Celsius.

Waschen Sie die Vero-Zellen zweimal mit PBS und Trypsineis. Nach der Reanimation werden die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM suspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Konzentration auf viermal 10 der vier Zellen pro Vertiefung ein, dann bereiten Sie 96-Well-Platten vor, um eine flüssige Flüssigkeit von 80 bis 90 % zu erreichen.

Am nächsten Tag. Schütteln Sie die Platten vorsichtig mit der Hand, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erhalten. Kultivieren Sie die Zellen für die Nacht am Tag der Infektion.

Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor Sie mit der Infektion fortfahren. Verdünnen Sie nun seriell das Virus, das Gewebekulturüberstände enthält, die zuvor optimal in einer 96-Well-Platte gewonnen wurden, und aspirieren Sie dann das Medium aus den ausgesäten Vero-Zellen. Waschen Sie sich zweimal mit 50 Mikrolitern PBS und infizieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern des seriell verdünnten Virus.

Infizieren Sie die Zellen für eineinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie anschließend das Virusinokulum bei 100 Mikrolitern Infektionsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 16 bis 18 Stunden lang. Entfernen Sie nun jeweils die Gewebekulturüberstände.

Fixieren Sie die Zellen gut mit 4% Formaldehyd, verdünnt in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann das Formaldehyd entfernen und mit 0,1% Trite X 100 bei Raumtemperatur 10 Minuten permeasen. Anschließend die Permeationslösung aspirieren und dreimal mit 100 Mikrolitern PBS-Lock-Zellen mit 2,5 % Rinderalbuminserum waschen.

Verdünnen Sie den primären Antikörper, der spezifisch für ein Arenavirus-Protein ist, in 2,5 % BSA und zentrifugieren Sie ihn 15 Minuten lang. Bei 3.500 U/min werden die Zellen mit dem Antikörper eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, nachdem sie dreimal PBS mit einem geeigneten Fluor-Vier-konjugierten Sekundärantikörper für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius gewaschen wurden. Entfernen Sie den Sekundärantikörper und waschen Sie ihn dreimal mit 100 Mikrolitern PBS.

Als nächstes titrieren Sie durch Zählen von fluoreszierenden Fokusformungseinheiten mittels Fluoreszenzmikroskopie. Ähnlich wie das rekombinante Wildtyp-Arenavirus. Titrieren Sie das tric segmentierte Virus, indem Sie zuerst das in der Gewebekultur vorhandene Virus seriell verdünnen, dann den Überstand infizieren Sie Vero-Zellen in 96 Well-Platten nach 16 bis 18 Stunden Inkubationszeit, titrieren Sie durch Zählen des Fluoreszenzfokus und bilden Sie Einheiten unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie.

Alternativ können Sie die erfolgreiche Virusrettung durch Gaia-Luciferase-Expression mit 100 Mikrolitern Gewebekulturüberständen in einer weißen 96-Well-Platte messen. Richten Sie das Luminometer gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein. Geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Gaia-Assay-Lösung zu jeder Probe.

Messen Sie dann die Expression des Gaia-Reportergens mit dem Luminometer als Negativkontrolle. Messung der Gaia-Expression aus TCS von Wildtyp-Virus-infizierten Zellen. Arena-Viren sind behüllte RNA-Viren mit negativem Sinn und bi-segmentierten Genomen.

Jedes Segment verwendet eine Ambi-Sense-Beschichtungsstrategie, um die Synthese von zwei viralen Proteinen zu steuern. In entgegengesetzter Ausrichtung werden zwei Arten von Rescue-Plasmiden zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in Vero-Zellen verwendet. Die PCA-Expressionsplasmide steuern die Synthese der viralen Proteine L und np.

Das humane Polymerase-ein-Plasmid steuert die Synthese der viralen RNA-Abschnitte. Die erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp-Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mittels IFA nach 16 bis 18 Stunden bestätigt. Nach der Infektion von Vero-Zellen durch Gewebekultur werden die überstehenden Zellen mit LCMV- oder Caniden-Nr. 1-spezifischen Antikörpern gefärbt.

Bei der Rettung der humanen Polymerase durch das Tris-segmentierte Arenavirus wird ein Plasmid in zwei Plasmide in einem Plasmid getrennt. NP wird durch GFP ersetzt und im anderen Plasmid wird das GP durch das Gaia-Gen ersetzt. Eine erfolgreiche Virusrettung kann einfach durch Beobachtung der GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden.

Darüber hinaus kann eine erfolgreiche Rettung durch die Beurteilung der Gaia-Expression bestätigt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl Wildtyp- als auch Tris-segmentierte Arenaviren in Vero-Zellen mit hoher Reproduzierbarkeit retten können. Wir empfehlen drei unabhängige Transfiktionen für jedes empfohlene Virus, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Rettung zu erhöhen, da schwere Zellen nicht leicht transfiziert werden können.