Name: Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour Burkholderia Espèces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez l'extraction protéique totale et l'électrophorèse 2D pour les espèces Burkholderia. Cette méthode permet de générer une carte protéomique bidimensionnelle et d'analyser l'expression différentielle des protéines.

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Ce travail a été soutenu par une bourse de l&#39;Université de la Colombie-Britannique (à BV) et des subventions de Fibrose kystique Canada et du Canada Instituts de recherche en santé (DPS) à. Nous remercions Jacqueline Chung pour la préparation initiale de protocoles.

Une. La croissance de la culture (Jours 1 +2) <ol><li> Cultiver une culture de départ: 3 ml de Luria Bertani (LB) dans un tube pression supérieure de 15 ml, à 37 ° C pendant la nuit de la coiffe. Diluer la croissance durant la nuit jusqu&#39;à une DO 600 de 0,6. Ajouter 1 ml de cette dilution à 100 ml de bouillon LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Incuber à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute pendant 16 heures en phase stationnaire (SP), pour mieux approximatif, en culture par lot, les conditions d&#39;infection et pour garantir que les facteurs de virulence bactérienne sous le contrôle d&#39;stationnaires facteurs de signal de phase tels que rpoS et quorum détection, elles sont exprimées. Sinon, les bactéries cultivées à SP début ou milieu de la phase ou la fin-logarithmique peuvent être utilisés pour obtenir des informations sur la phase d&#39;adaptation bactérienne. </li><li> Après 16 heures de mesurer la DO à 600 et d&#39;assurer la culture a atteint SP par rapport à une courbe de croissance construite précédemment dans des conditions identiques. </li></ol> 2. Extraction des protéines (Jour 3) <ol><li&gt; Réfrigérer tous les médias et des solutions avance dans le réfrigérateur pendant la nuit. Toutes les mesures doivent être réalisées avec des tubes dans un seau à glace. Prérefroidissement une micro et une centrifugeuse Beckman Coulter haute performance (ou équivalent) à 4 ° C et le rotor intérieur (rotor = JA-20, centrifugeuse J2 =-SH). </li><li> Préparer une solution fraîche 0,1 M phénylméthanesulfonyle fluorure (PMSF, 174,19 g / mol) dans de l&#39;acétone en dissolvant 0,0174 g de PMSF (PMSF &#39;ATTENTION&#39; est toxique et corrosif, l&#39;utilisation des écrans faciaux et des gants) dans 1 ml d&#39;acétone (acétone &#39;ATTENTION&#39; est toxique et inflammable, utiliser des écrans faciaux et des gants). </li><li> Préparer une solution de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de PMSF 0,1 M, 0,1 ml d&#39;EDTA 0,5 M, et 9,8 ml de PBS. Vérifiez la DO de la culture h 16 est à peu près où il devrait être dans SP. </li><li> Prendre 35 ml de la culture bactérienne et le transfert à un tube de centrifugeuse Oakridge et centrifuger la culture à 4500 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant à un conteneur de déchets etajouter 35 ml de PBS refroidi et remettre le culot. Centrifuger à 4500 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de PBS froid. Transfert à stériles Eppendorf de 2 ml et centrifuger 1 min en haut dans le centrifuger à 14 000 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de PBS / EDTA / PMSF, remettre le culot et le transfert à un 2 ml à vis tube à bouchon (avec joint torique) contenant ~ 0,5 ml de perles de verre (pré-stérilisés). Ajouter le culot remis en suspension dans le tube contenant les perles de verre et les perles bash à 4 ° C pendant 1 minute dans la chambre froide. Pour ce faire, 3x, mettre l&#39;échantillon sur la glace après chaque coup. </li><li> Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min dans la microcentrifugeuse. Enlever le surnageant et le mettre dans un 5 ml tube en polystyrène stérile. </li><li> Pour augmenter le rendement, ajouter 1 ml de PBS / EDTA / solution de PMSF à même tube contient encore des perles de verre. Bash bourrelet du tube à 4 ° C pendant 1 min. Ne ce 2x mettre l&#39;échantillon sur af glaceter bash. Centrifugeuse à 14 000 g pendant une minute à la centrifugeuse et enlever le surnageant et ajouter au surnageant de l&#39;étape 2.8. Utiliser une seringue de 1 ml et un filtre de 0,20 um le surnageant à partir du tube en polystyrène stérile à un nouveau tube de Eppendorf de 2 ml. </li><li> A ce stade, les échantillons doivent être analysés pour déterminer la quantité de protéines, en utilisant la protéine kit et des aliquotes de 200 ug extraction Pierce MicroBCA doit être congelé à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;échantillon (Jour 4) <ol><li> Préparer 25 ml réhydratation solution stock (8 M d&#39;urée, 2% de CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de bleu de bromophénol) et entreposer dans 2,5 ml aliquotes à -20 ° C. Ajouter 7 mg dithiothréitol (DTT, 154,2 g / mol) juste avant de les utiliser à une aliquote de solution de réhydratation des stocks de 2,5 ml. </li><li> Processus décongelé des échantillons de l&#39;étape 2.10 en utilisant un 2-D Clean up kit avec remise en suspension finale dans 450 pi de solution de réhydratation des stocks préparés à l&#39;étape 3.1. </li></ol> 4. PremièreDimension Isoélectrofocalisation (IEF) (Jour 4) Toutes les étapes de cette section utilisent le système IEF Ettan IGPhor. <ol><li> Mettre en place les IPG premières bandes de dimension: distributeurs de bande propres avec une solution de nettoyage de la bande, puis laver avec de l&#39;eau Milli-Q, laisser à l&#39;envers pour sécher. Assigner chaque échantillon à un numéro de support de bande de gel. </li><li> Charger l&#39;échantillon provenant de l&#39;étape de réhydratation dans la seconde zone plus grande de l&#39;extrémité (-). Utilisez une pince pour tirer propres bandes de gel sur l&#39;emballage. Sortez couche protectrice de bandes de gel. Ligne bandes côté rugueux vers le bas dans un mouvement lent glissement d&#39;obtenir les bandes humides le long du chemin de (-) à la fin (+) fin. </li><li> Mettez du papier buvard humide avec de l&#39;eau stérilisée au-dessus de l&#39;électrode et dans les bandes de gel pour prévenir l&#39;épuisement professionnel. Rincer pinces entre-deux tours avec de l&#39;eau purifiée et de l&#39;éthanol. Retirez toutes les bulles, superposer finement avec de l&#39;huile minérale pour éviter des déplacements secs. Aligner les supports de bande de gel sur la machine. </li><li> Exécutez 12 h à 20 ° C pour rehydration, 1 heure à 200 V, 1 heure à 500 V, 1 h à 1 000 V, 0,5 heure à 4000 V, 12 h à 8 000 V, 24 heures cale à 300 V et peut être retirée à ce moment. </li><li> Après IEF est terminé, il est recommandé d&#39;effectuer la deuxième dimension électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, à moins que la bande IPG sont en cours de congélation à -80 ° C en Saran Wrap enduit avec de l&#39;huile minérale pour une analyse ultérieure. En variante, afin d&#39;éviter le point de stries en raison de l&#39;accès de DTT, il est possible d&#39;inclure une seconde étape d&#39;équilibrage de l&#39;IPG strips avant la seconde dimension avec un tampon qui contient de l&#39;iodoacétamide. </li></ol> 5. Deuxième dimension SDS-polyacrylamide gel d&#39;électrophorèse (Jour 5) Toutes les étapes de cette section utilisent l&#39;appareil d&#39;électrophorèse Ettan DALTsix. <ol><li> Pour assembler l&#39;appareil gel en poudre, nettoyer soigneusement tous les composants et veiller à ce que le gel poudre est de niveau et la fixation caoutchouc gris est lubrifié avec du gel de silicone. Mettez le bât blesse noirber arrêt triangulaire sur le fond. Ensuite, placer alternativement le séparateur et les plaques de verre avec la plaque de verre inférieure de face. Assurez-vous que les séparateurs sont à l&#39;arrière et l&#39;avant. Remplir l&#39;espace restant avec les charges (environ 5 feuilles) de sorte que le sommet est plat. Mettez le panneau avant sur la pointe rouge à l&#39;extérieur. Utilisez des pinces pour serrer chaque côté et serrer les vis du bas. </li><li> Préparation du gel: Ajouter 297,3 ml de Duracryl, («ATTENTION» Duracryl est l&#39;utilisation toxique écrans faciaux et des gants), 147 ml de tampon Tris 1,5 M pH 8,8, et 143,3 ml d&#39;eau Milli-Q dans un ballon avec pointe à vide contenant un barre d&#39;agitation. Mettre le couvercle sur le dessus et une solution mélanger à vitesse modérée avec le vide pendant 20 min. Le vide est utilisé pour dégazer la solution. Prendre un nouveau 10% de la solution de persulfate d&#39;ammonium (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g d&#39;APS à 2 ml d&#39;eau Milli-Q. </li><li> Ajouter le mélange de gel à la poudre de gel: Lorsque le vide est fait d&#39;ajouter 6 ml de 10% de dodécylsulfate de sodium (SDS, 228,38 g / mol)sur le côté de la fiole pour éviter de mettre plus de bulles dans la solution. Ajouter APS, remuer, ajouter 0,25 ml de N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, 116,20 g / mol) («ATTENTION» TEMED est inflammable utilisation des écrans faciaux et des gants) et remuer. </li><li> Verser le mélange de gel dans le gel à travers un entonnoir de coulée inséré à l&#39;arrière de l&#39;appareil. Verser jusqu&#39;à un pouce en dessous de la plaque de court. Ajouter 1,5 ml de butanol saturé d&#39;eau à la surface du gel et envelopper le dessus avec une pellicule pour éviter la déshydratation. Attendez pendant 1 heure pour assurer la pleine polymérisation. </li><li> Vérification du gel: Lorsque le gel est fait (consultez le ballon), démonter le lanceur de gel par un évier. Vérifier l&#39;intégrité du gel pendant le rinçage des plaques de verre avec de l&#39;eau chaude, ne pas laisser l&#39;eau entrer dans la plaque. Verser le butanol et rincer le haut de gel deux fois avec de l&#39;eau pour se débarrasser de butanol. Remplissez le haut avec de l&#39;eau à nouveau et laisser reposer si les gels ne sont pas utilisés immédiatement. </li><li> Préparation des bandes: Préparer une solution de tampon d&#39;équilibrage à partir de lacongélateur (6 M d&#39;urée, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de bleu de bromophénol). Cela peut être préalablement préparé et stocké dans des aliquotes de 10 ml à -20 ° C. Dissoudre 0,1 g de DTT à 10 ml d&#39;une solution de tampon d&#39;équilibrage. Un tube peut être utilisé pour deux bandes IPG. Placez les gels de la face de la bande vers le bas sur le tampon et laisser reposer pendant 30 min. Rappelez-vous ce qui est fin, qui. </li><li> Préparation de l&#39;unité d&#39;électrophorèse (d&#39;un appareil de séparation 2-D): Ajouter 4,5 L de 1x électrophorèse tampon (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM de glycine [288,38 g / mol], et 0,1% p / v de SDS [288,38 g / mol]) à la cuve en cours d&#39;exécution. Ce tampon peut être utilisé pour un maximum de 3x. Mettez l&#39;appareil d&#39;électrophorèse sur. Vérifier le niveau d&#39;eau dans la machine de refroidissement par eau et remplissez-le avec de l&#39;eau si elle est faible. Allumez la machine, appuyez sur mode pour vérifier la température désignée, qui doit être de 10 ° C. </li><li> Assurez 1 L de tampon 2x course et 1 L de 1x de tampon de migration et de les stocker à 4 ° C. Préparer une solution d&#39;agarose-étanchéité: poids 0,25 g de agarose et le dissoudre dans 50 ml de tampon de 1x en cours d&#39;exécution. Pulse pendant 15 secondes chacun. </li><li> Mise en place de l&#39;unité d&#39;électrophorèse: Utilisez une pince à épiler à prendre sur chaque bande et retirer le tampon en excès des deux côtés de serviette en papier propre. NE PAS toucher les bandes. Verser l&#39;eau sur le dessus du gel et la ligne du haut de gel avec un tampon de 1x courante. Utilisez des pinces propres et placer les bandes sur le dessus de la plaque longue, avec le côté gel face à vous. Ajouter tampon 1x pour les bandes à lubrifier. bandes de diapositives plus loin en utilisant des bandes en plastique. Retirez toutes les bulles entre la bande et le gel. </li><li> Ajouter la solution d&#39;agarose-étanche à la partie supérieure de la bande pour le sceller. Répéter pour le reste des bandes. Placez les plaques de verre contenant les gels en gel berceau et inférieure dans le réservoir de gel. S&#39;assurer que le niveau de tampon 1x dans la chambre extérieure est sur la ligne de fond désigné avant de mettre la chambre supérieure sur. </li><li> Placez le cadre pour chambre tampon supérieur sur les plaques de verre et de s&#39;assurer qu&#39;il est d&#39;autant way descendre en appuyant sur le bas vers le bas. Utilisez un entonnoir et ajouter le tampon de migration 2x dans la chambre supérieure à la ligne médiane. Utilisez un entonnoir et ajouter tampon de course 1x à la chambre extérieure jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la ligne du haut. Placer le couvercle sur le dessus et allumer l&#39;appareil d&#39;électrophorèse et le bloc d&#39;alimentation. </li><li> Exécutez la nuit à 52 V, 96 mA, 5 W. Vérifiez si le courant va en recherchant des bulles sur le fil d&#39;argent vers le haut. Exécutez le gel jusqu&#39;à ce que la ligne éditoriale est de 1 cm du fond. </li><li> Les protéines peuvent également être analysées à l&#39;aide du matériel et des réactifs d&#39;autres sociétés telles BIORAD ou Hoefer, selon les instructions du fabricant. </li></ol> 6. Argent coloration des gels pour Gel visualisation (Jour 5-6) <ol><li> Préparer une solution d&#39;une solution (800 ml d&#39;éthanol, 200 ml d&#39;acide acétique et 1,000 ml d&#39;eau Milli-Q dans une hotte dans un seau en plastique). Solution est bonne pour 6 gels. Mettez toutes les machines hors tension et retirer la totalité de la section médiane de l&#39;unité d&#39;électrophorèse et d&#39;unité centralell il dans l&#39;évier. Mettre également à la barre blanche dans l&#39;évier. Tirez sur le plateau supérieur contenant le tampon 2x en cours. </li><li> Démonter l&#39;appareil et retirer les gels à partir des plaques de verre dans la solution de correctifs 1. Les gels peuvent être identifiés en coupant les coins quand ils sont retirés des plaques de verre, le nombre de coins coupés correspondant à l&#39;ordre de gel dans le lanceur. </li><li> Placer le récipient avec la solution de correction et les gels sur un balancier pendant au moins 1 h à une nuit à 4 ° C. </li><li> Transférer les gels de fixer Solution 2 (20 ml de glutaraldéhyde à 50%, 600 ml d&#39;éthanol, 5 g de tétrathionate de potassium (302,46 g / mol), 136 g d&#39;acétate de sodium (82,03 g / mol), et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) et les déposer sur une bascule pendant 1 heure. </li><li> Laver les gels 4x pendant 15 min chacun dans de l&#39;eau Milli-Q. </li><li> Colorer les gels dans la solution de nitrate d&#39;argent (4 g de nitrate d&#39;argent (169,87 g / mol), 500 ul de formaldehyde, et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 30 min ou jusqu&#39;à 48 h. </li><li> Laver gel pour 1min dans de l&#39;eau Milli-Q. </li><li> Transférer à la solution de révélateur (60 g de carbonate de sodium (105,99 g / mol), 300 ul de formaldehyde, 15 mg de thiosulfate de sodium (158,11 g / mol), et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 5 à 30 min jusqu&#39;à ce que l&#39; gel est coloré. </li><li> Mettre les gels dans la solution d&#39;arrêt (100 g de Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml d&#39;acide acétique et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 10 min. </li><li> Pour le stockage, le transfert des gels à la solution de glycérol (40 ml du glycérol ou 400 ml si le stockage à long terme est nécessaire, et 1600 ml d&#39;eau Milli-Q) pendant 10 min, puis les sécher à l&#39;aide d&#39;un sèche-gel. </li><li> Gels peuvent être visualisées après coloration à l&#39;aide de systèmes d&#39;imagerie comme un scanner / densitomètre, photographié en utilisant transilluminateur lumière ou Gel imageur. Logiciel d&#39;analyse de l&#39;image, comme PDQuest analyse 2-D de BIORAD peut ensuite être utilisé pour obtenir des informations quantitatives et qualitatives de protéines dans un échantillon. </li></ol> 7. Gel coloration à l&#39;argent pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse </p&gt; <ol><li> Fixer les gels dans 50% de méthanol, et de l&#39;acide acétique à 5% pendant 1 heure. </li><li> Laver à 50% de méthanol pendant au moins 10 min à une nuit. </li><li> Laver à l&#39;eau distillée 3x pendant 10 min. </li><li> Sensibiliser avec du thiosulfate de 0,02% de sodium (158,11 g / mol) 2x pendant 15 min. </li><li> Laver pendant 3x dans REFRIGERE 3x de l&#39;eau distillée pendant 10 min. </li><li> Immerger gel dans REFRIGERE solution de nitrate d&#39;argent à 1% (169,87 g / mol) pendant au moins 20 min à 1 h à 4 ° C </li><li> Laver 2x pendant 1 min à l&#39;eau distillée. Changer plateau / seau. </li><li> Développer dans 0,04% de formaldéhyde dans 2% de carbonate de sodium anhydre (105.99 g / mol) et jeter quand il devient jaune très rapide; avoir trois lots et être prêt à changer toutes les 5 min. </li><li> Laver dans de l&#39;acide acétique à 5% puis stocker dans de l&#39;acide acétique à 1%. </li><li> Rincer tubes de 1,5 ml Eppendorf (pour tenir obtenir place découpes) avec de l&#39;éthanol de qualité USP et sécher à l&#39;air avant de l&#39;utiliser. </li><li> Pinces propres, lames de rasoir et des surfaces avec 100% de méthanol. </li><li> Des gants et des surfaces de pulvérisation avec de l&#39;éthanol. </li><li> taches d&#39;accise dans une hotte à flux ou de la zone de l&#39;air pur. Les spots peuvent également être excisées en utilisant un couteau de place automatisé. </li><li> Mettez-les dans des tubes Eppendorf et bateau sur la glace ou de conserver dans le réfrigérateur. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Procédé de préparation de protéines a été décrite qui peut extraire la majorité des protéines Burkholderia avec une bonne reproductibilité. Ceci est démontré par l&#39;obtention du même profil de protéine à partir de deux préparations indépendantes réalisées en différents jours en utilisant la même culture bactérienne cultivée dans un bouillon LB ou de YEM comme représenté sur la figure 1. Extraction était efficace pour les bactéries cultivées dans un milieu liquide, mais nous n&#39;avons pas t...

Le genre Burkholderia comprend plus de 62 espèces, organismes Gram négatifs isolés à partir d&#39;une large gamme de niches, et elle est divisée en deux groupes principaux 1,2. Le premier groupe comprend des organismes phytotrophique humaine, animale et, et la plupart des études ont porté sur les espèces pathogènes de ce groupe en raison de leur importance clinique. Les membres les plus pathogènes sont B. pseudomallei et B. mallei (qui provoque melioidosis et morve respectivement) 3,4 et pathogènes opportunistes (les 17 espèces déterminées du complexe Burkholderia cepacia, BCC) 5, qui causent la maladie de la fibrose kystique (FK) et granulomatose chronique (CGD) 1. Le deuxième groupe, avec plus de 30 espèces non pathogènes, comprend bactéries associées aux plantes ou à l&#39;environnement, et sont considérés comme potentiellement bénéfique à l&#39;hôte 2. De nombreuses complications surgissent frinfection bactérienne om avec les éléments pathogènes du genre Burkholderia, tels que la transmission de l&#39;agent pathogène entre les patients, la propagation de la maladie et l&#39;échec du traitement en raison de la résistance intrinsèque ou acquise aux antibiotiques rend difficile à éliminer dans la plupart des cas, de 6 à 9. Par conséquent, acquérir une meilleure compréhension de la base pour l&#39;établissement d&#39;une infection bactérienne est essentiel pour le traitement des maladies causées par ces organismes. Afin de mieux comprendre la mise en place de l&#39;infection, des enquêtes approfondies sur les composants bactériens associés à la pathogenèse sont nécessaires. Les études portant sur ​​l&#39;analyse protéomique des organismes Burkholderia utilisant une approche protéomique décrits protéines qui ont été impliqués dans la pathogenèse bactérienne ainsi que des changements dans leur protéome Profils avec 10-16. méthodes d&#39;extraction des protéines à l&#39;aide de sonication et les cycles de gel-décongelés dans un tampon de lyse contenant une grande concentration de l&#39;urée, de la thio-urée en combinaison avec un détergent et ampholytes a été appliquée dans des études protéomiques Burkholderia 10-13. Bien que l&#39;urée est tout à fait efficace pour la dénaturation des protéines, on peut établir un équilibre en solution aqueuse avec de l&#39;isocyanate d&#39;ammonium, qui peut réagir avec les groupes d&#39;acides aminés, en formant ainsi des artefacts (réaction de carbamylation) 17. Par conséquent, il est recommandé d&#39;inclure des ampholytes porteurs, qui agissent comme piégeurs de cyanate et d&#39;éviter des températures supérieures à 37 ° C 17. En outre, pour éviter toute interférence chimique de tampon de lyse avec de la protéine quantification, le même tampon de lyse peut être utilisé pour générer la courbe d&#39;étalonnage de telle sorte que les échantillons et les standards ont le même fond 10. D&#39;autres méthodes impliquent l&#39;utilisation de tampons et détergents alcalins avec des périodes d&#39;incubation de chaleur 17,18, mais ces conditions pourraient induire des changements dans le protéome et certains détergents sont pas compatibles avec proteomics demande si des mesures ultérieures d&#39;élimination de détergent sont inclus 17,18. Après l&#39;extraction et la quantification adéquate, expression de la protéine globale de chaque protéine individuelle peut être étudiée en utilisant des approches protéomiques telles que deux dimensions (2-D) électrophorèse sur gel. Cette technique a été décrite par O&#39;Farell 19 et consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, et ensuite en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel d&#39;acrylamide dans la seconde dimension. En raison de sa sensibilité et de résolution, cette technique est un outil puissant pour l&#39;analyse et la détection des protéines provenant de sources biologiques complexes 19,20. Cette technique de séparation est actuellement disponible dans les approches de protéines centrée avec le grand avantage de résoudre isoformes de protéines causées par des modifications post-transcriptionnelles ou traitement protéolytique. Les changements quantitatifspeut être détectée en comparant l&#39;intensité de la tache correspondant après coloration du gel 20. Cependant, cette technique n&#39;est pas adaptée pour l&#39;identification de très grosses protéines, des protéines membranaires, des protéines extrêmement acides ou basiques et hydrophobes, et est une technique assez laborieux et prend du temps 20. De nouvelles approches de peptides centrée (à base de gel non) qui sont plus robustes et objective deviennent disponibles et peuvent être utilisés pour la comparaison quantitative par des méthodes stable de marquage isotopique différentielles telles que l&#39;étiquetage de la cystéine par affinité isotope codé marquage (ICAT) 21, et un groupe amino étiquetage par isotopes marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) 22. L&#39;utilisation d&#39;une technique de protéomique unique pourrait donner des informations insuffisantes, par conséquent l&#39;utilisation de deux approches protéomiques complémentaires est nécessaire pour la plupart des changements évaluer pleinement dans protéome. Néanmoins, l&#39;électrophorèse sur gel 2-D est largement utilisé et peut être appliquée de façon routinière pour la quanquantitatif expression de plusieurs protéines dans des organismes différents. Nous décrivons ici une extraction de protéines à cellules entières et les procédures d&#39;électrophorèse sur gel 2-D pour les espèces de Burkholderia qui ont été adaptés et optimisés à partir des 2-D Principes électrophorèse GE Healthcare et méthodes Manuel 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). L&#39;extraction de la protéine a été effectuée en utilisant un batteur de billes avec des billes de verre en présence de PBS contenant 5 mM d&#39;EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cette procédure permet la quantification des protéines avec une dégradation minimale et est modifiable pour les approches protéomiques Comme indiqué précédemment 15,23,24. Électrophorèse sur gel 2-D a été effectuée en utilisant 24 cm de long immobilisées pH 4-7 gradient et les protéines ont été séparées en fonction de leur point isoélectrique. Ensuite, les protéines ont été séparées en fonction de leur Molecpoids culier par gel SDS-polyacrylamide. De plus, nous avons décrit un procédé de coloration à l&#39;argent pour la visualisation des protéines d&#39;accompagnement, et un procédé de coloration à l&#39;argent qui est compatible pour l&#39;analyse par spectrométrie de masse. Ensemble, ces procédures peuvent permettre l&#39;identification de protéines importantes d&#39;espèces Burkholderia qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Toxique, corrosif</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td> Tampon PBS <td>inflammable</td></tr><tr><td></td><td>Bioscience</td><td>R028</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>toxique</td></tr><tr><td>Billes de verre (0,1 mm)</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge Tubes à centrifuger, polycarbonate (50 ml)</td><td>VWR</td><td>21009-342</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de protéines MicroBCA</td><td>Pierce</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger 2,0 ml Tubes coniques à bouchon à vis avec bouchon et joint torique</td><td>Fisher</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage 2D</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Invitrogen</td><td>15505-050</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>MPBiomédical, LCC</td><td>856126</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td><td>Amersham Biosciences</td><td>176002-46</td><td></td></tr><tr><td>Duracryl</td><td>Proteomic Solutions</td><td>80-0148</td><td>Très toxique, cancérigène</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Fisher</td><td>BP179-100</td><td>Inflammable, toxique, corrosif</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium inflammable (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Toxicité aiguë, inflammable</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher</td><td>HC1100-1GL</td><td>Inflammable, toxique</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td>Inflammable, corrosif</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Fisher</td><td>G151-1</td><td>Très toxique, corrosif, dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>Tétrathionate de potassium</td><td>Sigma</td><td>P2926</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>EM Science</td><td>7510</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>Sigma</td><td>209139</td><td>Corrosif, dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td>Toxique</td></tr><tr><td>Thiosulfate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>EMD</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MPBiomédical, LCC</td><td>808831</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>MPBiomédical, LCC</td><td>800688</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Inflammable, toxique, dangereux pour la santé</td></tr><tr><td>Carbonate de sodium anhydre</td><td>EMD</td><td>SX0400-3</td><td>Toxique</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>ACROS</td><td>415080010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>JA-20 rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Système de mise au point isoélectrique Ettan IPGphor II et accessoires</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6505-03</td><td><a href="http://www.amershambiosciences.com » target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td></tr><tr><td>Ettan DALT Large Système d’électrophorèse verticale</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-27</td><td><a href="http://www.amershambiosciences.com » target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td></tr></tbody></table>

extraction des protéines totales et 2-d méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; burkholderia</em&gt; espèces

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

L&#39;enquête sur les niveaux de protéines intracellulaires d&#39;espèces bactériennes est importante pour la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies causées par ces organismes. Nous décrivons ici un procédé pour l&#39;extraction des protéines à partir de Burkholderia espèces sur la base de la lyse mécanique à l&#39;aide de billes de verre en présence d&#39;acide éthylène-diamine tétra-acétique et de fluorure de phénylméthylsulfonyle dans du tampon phosphate salin. Cette méthode peut être utilisée pour différentes espèces Burkholderia, pour différentes conditions de croissance, et il est probable adapté pour l&#39;utilisation dans des études de protéomique d&#39;autres bactéries. Après l&#39;extraction de la protéine, un (2-D) électrophorèse sur gel technique protéomique deux dimensions est décrit pour étudier les changements mondiaux dans les protéomes de ces organismes. Cette méthode consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, suivie d&#39;une séparation sur la base du poids moléculairepar électrophorèse sur gel d&#39;acrylamide dans la seconde dimension. Visualisation de protéines séparées est effectuée par coloration à l&#39;argent.

L&#39;analyse comparative des profils protéiques extraites de la même culture bactérienne à deux reprises a montré des tendances similaires bandes indiquant les extractions de protéines succès. Protéines de poids moléculaire extraits variaient de 10 à 150 kDa. Montre la figure 1 représentant de Coomassie gel de coloration bleue des extractions de protéines à cellules entières de multivorans Burkholderia (un membre de la BCC) isolats cliniques cultivées en LB ou levure / Manitol (YEM) de bouillo...

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d&#39;importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l&#39;extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d&#39;électrophorèse 2D pour l&#39;analyse protéomique ultérieure.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

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