Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die transkriptionelle Aktivität in virusinfizierten Zellen zu analysieren. Infizieren Sie zuerst die 2 9 3 Zellen mit dem Rifttalfieber-Virus, MP 12. Dann markieren Sie die Zellen mit dem Uridin-Analogon fünf Hanal-Uridin, das in die entstehende RNA eingebaut wird.

Nächstes Paar, das fünf Hanaluridin zu einem fluoreszierenden Azid einbaut. Um die erhaltenen Ergebnisse der neu synthetisierten RNA zu visualisieren, wurden die Unterschiede in der Menge der neu synthetisierten RNA zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen entweder mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie bewertet. Im Gegensatz zur Markierung mit tritiiertem, Uridin- oder Fünf-Brom-Uin erfordert dieser Click-Chemie-Ansatz keine Verwendung von radioaktiven Isotopen.

Sie ist auch schneller und empfindlicher als die Anti-Roma-UIN-Immunfärbung. Die Idee für diese Methode entstand aus unserem Bedürfnis nach einer schnellen und zuverlässigen Methode zur Messung der Transkriptionssuppression in Zellen, die mit unterschiedlicher Driftqualität, weniger Viren und P 12 s Spot infiziert sind. Eine 12 Millimeter breite Abdeckung wird in jede Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte geschoben.

Dann säen Sie 2, 9 3 Zellen in einem Millimeter vollständigem DMEM-Medium, inkubieren Sie die Zellen im befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid über Nacht. Gemäß dem Versuchsdesign wird der Virusbestand so verdünnt, dass die Infektion der Zellen mit MP 12 bei einer Infektionsmehrheit von drei in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung erfolgt. Ein Zeichen sowohl für die nicht infizierte Kontrolle als auch für die Kontrolle der transkriptionellen Suppression.

Entfernen Sie nun das Wachstumsmedium. Fügen Sie das virale Inokulum hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang im befeuchteten Inkubator. Aspirieren Sie das Inokulum.

Fügen Sie einen Milliliter frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 15 Stunden nach der Infektion bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch ein Medium, das ein Millimolar des Uridinanalogons enthält. Fünf Etaluridin in einen der scheininfizierten Vertiefungen.

Fügen Sie auch fünf Mikrogramm pro Milliliter des Inhibitors der DNA-abhängigen RNA-Synthese hinzu. Antimycin D. Bringen Sie die Zellen 16 Stunden nach der Infektion in den Inkubator zurück. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Deckgläser einmal mit einem Milliliter PBS pro Well, fixieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 4%para-Formaldehyd pro Well.

Spülen Sie einmal mit einem Milliliter PBS pro Vertiefung. Um die Feuchtkammer zusammenzubauen, legen Sie den Boden einer Zellkultur oder Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern mit einer Paraffinfolie aus Kunststoff aus. Die Innenseite des Rand der Schüssel mit feuchten Küchenpapier auslegen.

Um nun die Zellen zu permeasen, fügen Sie einen Milliliter 0,2 % Tritton X 100 in PBS hinzu, inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur nach drei PBS-Wäschen, übertragen Sie die Deckgläser in die Feuchtkammer für die Klickreaktion, um die markierte RNA-Abdeckung nachzuweisen. Jedes Deckglas mit 50 bis 100 Mikrolitern frisch zubereiteter Click-Färbelösung inkubiert eine Stunde lang. Fügen Sie im Dunkeln Raumtemperatur hinzu.

Geben Sie einen Milliliter PBS in die Vertiefungen einer frischen 12. Platte und übertragen Sie die Deckfolien in die Vertiefungen, waschen Sie sie zwei weitere Male mit einem Milliliter PBS pro Vertiefung, um die Zellen einzubetten. Für die Fluoreszenzmikroskopie geben Sie einen Tropfen Flora Mount G auf einen Objektträger.

Tauchen Sie den Deckslip in Wasser. Entfernen Sie das überschüssige Wasser. Legen Sie die Hülle mit der Zellseite nach unten in den Tropfen Flora, Mount G, und trocknen Sie sie fünf Minuten lang an der Luft.

Infizieren Sie gemäß dem Versuchsdesign die 2 9 3 Zellen mit MP 12. Fügen Sie ein Trägheitsmoment von drei hinzu. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie verdünntes Virusmaterial hinzu und inkubieren Sie es eine Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie das Inokulum durch zwei Milliliter frischen Wuchs, mittel pro Vertiefung, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, um eine optimale Zeit für die Virusmarkierung und -ernte zu haben. Ersetzen Sie dann das Wachstumsmedium durch ein Medium, das 0,5 Millimolare fünf Hanaluridin enthält, in eine der scheininfizierten Vertiefungen. Fügen Sie auch fünf Mikrogramm pro Milliliter Acton Mycin D hinzu. Bringen Sie die Zellen nach einer PBS-Wäsche für eine Stunde in den Inkubator zurück und ernten Sie die Zellen mit Trypsin.

Waschen Sie die geernteten Zellen dreimal mit PBS, das ein millimolares EDTA enthält. Um die Zellen zu fixieren, resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter 4%PFA und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Einmal mit einem Milliliter P-B-S-E-D-T-A pro Tube waschen.

Dann permieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern 0,2% Triton X 100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Einmal mit einem Milliliter nukleasefreiem PBS für die Click-Reaktion waschen. Resus suspendieren Sie die Zellpellets in 200 Mikrolitern Klick-Färbelösung, die den Fluoreszenzfarbstoff enthält.

Wenn die Zellen verklumpen, wird die Wiederbelebung durch Pipettieren ausgesetzt, eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, zweimal mit Faxpuffer gewaschen. In diesem Experiment wurden 2 9 3 Zellen mit MP 12 und einem Deletionsmutantenvirus infiziert, dem die Fähigkeit fehlt, die Transkription von Wirtszellen zu unterdrücken. In den scheininfizierten Zellen erscheinen die Zellkerne aufgrund der laufenden Transkription hellrot.

Da die Zellen nur eine Stunde lang mit EU markiert wurden, gefolgt von einer sofortigen Fixierung, verbleiben die meisten RNAs im Zellkern. Im Gegensatz dazu ist bei der Behandlung von Zellen mit ACT Antimycin D zur pharmakologischen Hemmung der Transkription die rote Fluoreszenz der Zellkerne deutlich reduziert. Diese Fluoreszenz ist in ähnlicher Weise reduziert, wenn Zellen mit MP 12 infiziert werden, nicht aber mit der Deletionsmutante

Dadurch wird die Wirtstranskription nicht unterdrückt. Hier wurden die Zellen mit in vitro synthetisierter mRNA transfiziert, anstatt mit dem lebenden Virus infiziert zu werden. Das rot fluoreszierende Signal in den Zellkernen deutet darauf hin, dass Zellen, die mit mRNA transfiziert wurden, die für grün fluoreszierendes Protein kodiert, im Vergleich zu nicht resezierten Zellen keine Veränderung der Transkriptionsaktivität aufwiesen.

Der Virulenzfaktor N SS führt zu einer verminderten roten Fluoreszenz. Bei der Quantifizierung können die erhaltenen Durchflusszytometriedaten als Streudiagramme dargestellt werden, wobei das Fluoreszenzsignal für den Einbau der EU in die naszierende RNA auf der Y-Achse und das Signal für die Färbung des Anti-Rift-Valley-Fieber-Virus auf der X-Achse aufgetragen wird. Die Quadranten-Gates wurden so gesetzt, dass sich die Mehrheit der scheininfizierten Zellen im oberen linken Quadranten befand.

Die Mehrheit der aktyen DRE-Zellen befand sich im unteren linken Quadranten und die Mehrheit der infizierten Zellen in der rechten Hälfte des Diagramms. Wenn die Zellen mit MP 1280 infiziert wurden, zeigten 1,5 % der Gesamtzellen oder 93 % der positiven Zellen des Anti-Rift-Valley-Fieber-Virus eine verminderte transkriptionelle Aktivität. Im Gegensatz dazu zeigten bei einer Infektion von Zellen mit R MP 12 Klon 13 91,6 % der Gesamtzellen oder 97 % der positiven Zellen des Anti-Rift-Valley-Fieber-Virus eine transkriptionelle Aktivität, die mit der von M-infizierten Zellen vergleichbar war.

Diese Daten können auch in Form eines Histogramms für Fluoreszenz, RNA-Markierung mit EU-Einbindung dargestellt werden. Im Anschluss daran können weitere Methoden wie die intrazelluläre Immunfärbung durchgeführt werden, um die Expression von viralen Proteinen in diesen Zellen sichtbar zu machen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Klickchemie nutzen können, um die Transkriptionsaktivität in virusinfizierten Zellen zu visualisieren, entweder durch Fluoreszenzmikroskopie oder durch Durchflusszytometrie.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infektiösen Viren äußerst gefährlich sein kann, also treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA und das Vermeiden des Einatmens von Aerosolen.