In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den FLX pump me AB aus Pseudomonas aosa mit Hilfe eines Funktionstests zu untersuchen, der auf der Rekonstitution von Membranproteinen basiert. In Liposomen. Dies wird erreicht, indem zunächst Membranproteine überexprimiert und gereinigt werden, dann gemischtes B und bakterielles Rodin in Bakterienmembranproteinen aus den Membranen extrahiert und durch Affinitätschromatographie rein gereinigt werden.

Der zweite Schritt besteht darin, Liposomen herzustellen, indem ein getrockneter Lipidfilm mit einem purinhaltigen Puffer kombiniert wird, was zur Bildung von Multilam-Vesikeln führt. Nach der Beschallung werden die Liposomen extrudiert, um eine homogene Population von Liposomen zu erhalten. Als nächstes werden Detergenzienmembranproteine und dann Polystyrolkügelchen zur Liposomenlösung hinzugefügt.

Die hydrophoben Schwänze des Waschmittels absorbieren die Polystyrolkügelchen, so dass die Membranproteine dann das Waschmittelband lösen und in die Liposomenmembran eindringen können. Der letzte Schritt ist die Entfernung von nicht verkapseltem Purin. Indem die Protea-Liposomen auf einer Entsalzungssäule laufen, erreichen große Prot-Liposomen den Boden der Säule viel schneller als nicht verkapseltes Purin, das am oberen Ende der Säule festgeschnallt bleibt. Letztendlich werden protale Liposomen gesammelt und ihre Fluoreszenz verwendet, um die Mex AB-Aktivität durch die Änderung des pH-Werts zu untersuchen, die bei der Beleuchtung von bakteriellem Opsin entsteht.

Rodin-Effekt-Pumpen sind Transporter, die die Antibiotikaresistenz fördern. Aufgrund der Erkennung und des Transports einer breiten Palette von Substraten aus allen Antibiotikafamilien besteht ein dringender Bedarf an neuen und zuverlässigen In-vitro-Aktivitätstests für Membranproteineffekte. Transporter. In der Tat würden solche Assays neue Einblicke in die molekularen Mechanismen des Transports bieten und das pharmakologische Screening neuer potenzieller Inhibitorkandidaten unterstützen. Wir konzentrieren uns auf den Mix a Mix, B-O-P-R-M, eFlex Perm von Pseudomona Gin.

Wir präsentieren technische Ratschläge und Methoden, die erforderlich sind, um drei Anforderungen für die Entwicklung eines effizienten In-vitro-Funktionstests für das Mischen einer B-ffl-Pumpe zu erfüllen, einschließlich der Konstitution des Proteins in einer Membran, der Verwendung eines geschlossenen Kompartiments, das für den vektoriellen Transport des Substrats erforderlich ist, einer feinen Darstellung von Rauchabzügen und Matrize, die künstliche Effekte aufgrund der adro-Beschaffenheit des Substrats und der Erzeugung eines Proteingradienten vermeidet, der für die Mischung AB erforderlich ist Funktion. Die Stärke unseres Assays liegt in der Art und Weise, wie wir einen reproduzierbaren T-fähigen und reversiblen Pro-Gradienten erzeugen, um einen Delta-pH-Wert zu erzeugen, den wir nstitute Bacteria oder VR nennen, mit Mix AB in einer Liposomenmembran. BR ist ein Membranprotein, das aus der violetten Membran von aob salinium allic Marin gramnegative, obligat aerobe aans gereinigt wird.

Bei Beleuchtung pumpt dieses Protein aktiv Proteine. Wenn BR also zusammen mit dem Protein im Liposom konstituiert wird, erzeugt die Eliminierung des Liposoms aufgrund des br, das Proteine in die Liposomen pumpt, einen Delta-pH-Wert. Die Herstellung von reinem und stabilem Proteinmaterial ist von größter Bedeutung.

Reinigungsverfahren für Membranproteine macht B wurde in einer früheren Filmveröffentlichung von J ovy schön beschrieben, sowie in dem Textprotokoll, das dieses Video begleitet, in dem auch eine Beschreibung der Reinigung eines Membranproteinmixes A zu finden ist. Zur Herstellung von bakteriellem Rodin aus Halabach Salinium züchten Sie Halabach Saliniumzellen unter Beleuchtung bei 37 Grad Celsius für 10 Tage. Zerstören Sie die Zellen in einem flüssigen Wachstumsmedium, indem Sie gegen deionisiertes Wasser dialysieren. Reinigen Sie die violette Membran auf einem Saccharosegradienten von 30 bis 40 %.

Als nächstes lösen Sie die Membransuspension mit 2%igem Oktalglukozid. Waren 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Schützen Sie die Röhre vor Licht, indem Sie sie in Alufolie einwickeln.

Schätzen Sie die Konzentration von löslichen Bakterien oder Dosin unter Verwendung des im Textprotokoll aufgeführten Extinktionskoeffizienten kurz vor der Rekonstitution. Ultrazentrifugieren Sie das solubilizierte bakterielle Opsin, um Lipide loszuwerden und Proteine zu lösen. Um die Liposomen in einem Glaslautsprecher zuzubereiten, wiegen Sie 1,5 Milligramm Cholesterin ab, das als Pulver gelagert ist, und fügen Sie 400 Mikroliter Diol, Phosphatidylcholin oder DOPC, gelöst in Chloroform, in einem Glasbecherglas gelöst, und trocknen Sie sie mindestens eine Stunde lang unter Vakuum in einem Glasbecherglas, kurz bevor Sie sie manipulieren.

Das resultierende molare Verhältnis von DOPC zu Cholesterin beträgt 3,3 zu eins. Nachdem sie die Lipide mit einem Milliliter Hebespuffer getrocknet haben, sollte die Suspension turid erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Lösung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erhitzt, 10 Minuten lang bei 40 Watt mit abwechselnden 32. Impuls- und 32. Pausenzyklen bei Raumtemperatur beschallt, die Suspension sollte klar erscheinen.

In diesem Stadium besteht der kritischste Aspekt des Verfahrens darin, eine feste und monodispergierte Suspension von Liposomen zu erhalten. Um dies zu erreichen, legen wir bei der Einrichtung des zusätzlichen Rings äußerste Sorgfalt walten lassen, damit keine Leckage auftritt. Außerdem reinigen wir das Gerät nach jedem Gebrauch sehr sorgfältig.

Um eine monodisperse Population von Liposomen zu erhalten, führen Sie für jeden Zyklus zwei Extrusionszyklen durch. Lassen Sie die Liposomensuspension mindestens 11 Mal durch den Filter. Verwenden Sie für den ersten Zyklus eine Membranporengröße von 200 Nanometern und für den zweiten Zyklus eine Membranporengröße von 100 Nanometern.

An dieser Stelle können dynamische Lichtstreuungsmessungen durchgeführt werden, um die Homogenität der Suspension zu überprüfen. Hier sehen Sie ein typisches Ergebnis dieses Schritts. Membranproteine können in Liposomen aufgrund der löslichen Wirkung von Detergenzien rekonstituiert werden.

Solubilisierte Liposomen werden mit dem Detergens solubilisiertes Membranprotein inkubiert und bilden die Protea. Liposomen werden durch eine schnelle Eliminierung des Reinigungsmittels mit Polystyrolkügelchen ausgelöst. Um Protein einzubauen, fügen Sie 28 Milligramm Tritton X 100 hinzu und inkubieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius.

Geben Sie das lösliche Protein des Detergens, einschließlich der Bakterien Opsin Mex B und Mex A, zu den löslichen Liposomen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Fügen Sie zuvor aktivierte Styroporkügelchen hinzu. Fügen Sie ein Verhältnis von 30 zu eins zwischen Bienen und Waschmittel hinzu und inkubieren Sie fünf Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Unter sanftem Rühren werden die Protia-Liposomen, das Protein und die freien Substrate mit einer PD 10-Entsalzungssäule gereinigt, die mit dem Hess-Puffer äquilibriert ist. Um zu überprüfen, ob sowohl das Mex B als auch das Bakterium Opsin in Liposomen rekonstituiert wurden, reinigen Sie die Protea-Liposomensuspension auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten. Setzen Sie das Proteosom vorsichtig auf einem fünflagigen Gradienten aus Saccharose ab.

Nach der Ultra-Zentrifugation wird eine 17-stündige Ultrazentrifuge bei hunderttausend G durchgeführt, wobei sich aggregierte Proteine am Boden des Röhrchens befinden, während sich am oberen Rand des Röhrchens nicht eingebaute Detergenz-Solubilizenproteine befinden. Protea, Liposomen und Liposomen befinden sich an Saccharose-Grenzflächen, die ihrer intrinsischen Dichte entsprechen. Leere Liposomen werden weiter oben im Gradienten zurückgewonnen als die Prot-Liposomen.

Sammeln Sie die verschiedenen Gradientenfraktionen sorgfältig, bevor Sie sie mit Natrium-Dylsulfat analysieren. Polyacrylamid-Gelelektrophorese mittels Kumasi-Färbung oder Western Blotting. Führen Sie Fluoreszenzmessungen bei 25 Grad Celsius mit einem spektralen Fluorimeter durch, das Messungen mit zwei Wellenlängen ermöglicht.

Wechseln Sie die Beleuchtungsperioden zur Aktivierung von bakteriellem Rodin, das durch Anregungs- und Emissionswellenlängen von 550 Nanometern gekennzeichnet ist, mit Messungen der Purinfluoreszenz ab, die durch eine Anregungswellenlänge von 455 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 509 Nanometern für zwei Sekunden gekennzeichnet sind. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionsbandbreiten auf fünf Nanometer ein. Führen Sie die Messungen in Gegenwart von 50 nanomolaren Liny durch, um die Bildung eines umgekehrten Membranpotentials zu verhindern.

Der hier gezeigte Delta-Seufzer ist eine repräsentative Kontrolle, die mit dem Assay in Abwesenheit von Mex a, Mex B erhalten wurde und bestätigt, dass der durch das bakterielle Stäbchen-Opsin erzeugte Protonengradient reversibel ist. Nach einem Ansäuerungszyklus werden Oreo-Liposomen 45 Minuten lang im Dunkeln gehalten, damit das Bakterium Opsin aufhört, Protonen zu pumpen. Nach dieser Erholungszeit ist die Aktivierung des Bakteriums Opsin einfach durch Beleuchten derselben Suspension möglich.

Auch hier zeigt eine tatsächliche Transportmessung, dass eine Negativkontrolle mit proteinfreien Liposomen bei Beleuchtung erwartungsgemäß einen konstanten pH-Wert aufweist. Protea-Liposomen, die Bakterien oder Opsin in ihren Membranen enthalten, pumpen jedoch Protonen. Dadurch sinkt der pH-Wert im Inneren der Liposomen und es entsteht ein stabiler Gradient

Graue Dreiecke stellen den pH-Wert im Inneren von Protea-Liposomen dar, die Bakterien oder Opsin und Mex B in Gegenwart von Hoax. 3, 3, 3, 4, 2 Farbstoff enthalten. Während die roten Diamanten den pH-Wert in Abwesenheit des Farbstoffs darstellen, wird eine substratunabhängige Aktivität beobachtet, bei der ein Protonengradient nur teilweise durch den Mex B-Gegentransport abgebaut wird, was auf eine basale Aktivität von Mex zurückgeführt wird, B.In um die Wirkung von Mex A auf die Aktivität von Mex b zu testen, wurde Mex A zuerst zur Rekonstitution hinzugefügt.

In Abwesenheit jeglichen Substrats wird der durch das bakterielle Opsin erzeugte Protonengradient wiederum nur teilweise abgebaut. Die eigentliche Transportmessung wird an derselben Probe durchgeführt, das Proton wird initialisiert und das Substrat wird in die Suspension gegeben, um seine Bindungsstelle im Protein zu erreichen. Bei der anschließenden Beleuchtung kann man sehen, dass der durch das bakterielle Opsin erzeugte Protonengradient nun von Mex AB als Folge des Substrattransports durch die Pumpe vollständig dissipiert wird. Es ist wichtig zu bedenken, dass die genauen Bedingungen, die für die Anpassung dieses Protokolls an ein anderes Protein erforderlich sind, von dem hier beschriebenen abweichen können.

der Optimierung der folgenden Parameter muss darauf geachtet werden: Qualität der Reinigung, Effizienz des Waschmittels, Desorption des Solubilisierungsschritts des Waschmittels, Lipidzusammensetzung und Lipid-Protein-Verhältnis. Darüber hinaus können Temperatur und Inkubationszeiten all diese Parameter beeinflussen. Unser Protokoll ebnet den Weg zu einem besseren Verständnis der Aktivität des r and d flix Pump Mix B. Nichtsdestotrotz, wenn es speziell für r und d Transporter verkauft wurde, könnte diese Methode an jeden PMF aktivierten FFL Spam Transporter angepasst werden.