عزل الغدد متعددة الخلايا القابلة للحياة من أنسجة النبات آكل اللحوم ، Nepenthes

نطاق الطريقة المقدمة هو الحصول على غدد مفردة ونقية من الأنسجة النباتية الطازجة للتحليل الجزيئي. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد إبريق أولا من نبات نيبينث. ثم يتم تثبيت الأنسجة مباشرة على منصة أخذ عينات دقيقة على الجليد للحفاظ على نضارة الأنسجة.

أثناء إجراء أخذ العينات الدقيقة ، يتم عزل الغدد بطريقة دقيقة ونقلها إلى أنبوب PCR قبل إجراء تحليل PCR الكمي على المادة المحصودة. في النهاية ، يتم استخدام تقنية أخذ العينات الدقيقة الميكانيكية للحصول على غدد مفردة ونقية من نباتات القنب من أجل توفير أنسجة معينة بسرعة وبشكل جراحي لمزيد من التحليل الجزيئي. نباتات الكرنفالات متخصصة بين النباتات لأنها قادرة على هضم البروتين الحيواني.

لا تزال معرفتنا بكيفية عمل ذلك على المستوى الجزيئي محدودة. النموذج الجيد لمعالجة هذا السؤال هو مزيج الصور من الزائدة العبقرية لأنه يحتوي على أعضاء مميزة ، وصور تنتج الغدد ، والتي تساهم في عمليات الهضم هذه. في الملحق.

هذه الغدد داخل الصور في الأسفل. للتحليل الجزيئي ، من الضروري عزل هذه الهياكل العريضة والمسطحة ، التي يبلغ قطرها حوالي 100 إلى 200 ميكرومتر مباشرة من الأنسجة الطازجة. لجعل الأمر أكثر صعوبة ، يتم تغطية الغدد بغطاء واقي.

يتطلب وجود هيكل مشابه للمرآب ملاحظات ثلاثية الأبعاد أثناء أخذ العينات ، بالإضافة إلى أداة يمكنها التحرك في ثلاثة أبعاد بطريقة دقيقة. تعلمنا أن تقنيات التشريح الدقيق الحالية لم يتم إجراؤها لحل مشاكلنا. فشل الليزر ، على سبيل المثال ، بسبب المحتوى المائي العالي للأنسجة النباتية.

لذلك ، قررنا استخدام واستخدام تقنية تشريح ميكانيكية دقيقة جديدة تسمى aika ، وهي لعزل أجزاء من الأنسجة أو حتى الخلايا المفردة من الهياكل ثلاثية الأبعاد. يتكون من مجهر ستيريو أو مجهر مجموع حيث يتم دمج مناور صغير ثلاثي الأبعاد بطريقة يمكن أن تصل بسهولة إلى جسم مسطح جدا أو مرتفع جدا. إنه يتحرك فقط مع المجهر كركيزة لأخذ عينات من النباتات ، وغالبا ما نستخدم الشعيرات الدموية الدقيقة.

ومع ذلك ، في حالة زجاج الزائدة الدودية ، وجدنا أن الملقط الدقيق الذي يحركه PTO يعمل بشكل أكثر فاعلية في إجراءاتنا. مع الملحق ، تم تعديل المنصة. تدعم مرحلة VXY الصغيرة حاوية للإبلاغ مملوءة بالثلج كبيرة بما يكفي لحمل عينة الأنسجة مع حاملها وكذلك المكان الذي يجب خلع فيه الغدة.

يتأكد الجليد من إبطاء عمليات التدرج داخل الأنسجة لدرجة أنه من الممكن التعرف على الأنسجة. الحالة الجزيئية الأصلية ، تم إنشاء الإجراء التالي من الجزء السفلي من الصورة. يتم استئصال قطعة من حوالي سنتيمتر مربع إلى سنتيمترين مربعين ثم تسويتها.

ثم يتم تثبيت الأنسجة على زجاج جسم عن طريق شريط على الوجهين. عينة الأنسجة هذه مغطاة بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي ويتم الحفاظ عليها رطبة أثناء عملية أخذ العينات. ثم يتم وضع العينة مع الغدد ، والأغطية الواقية التي تواجه جانب المناور.

يجب تعديل الزاوية بين العينة والأداة بحيث تكون الغدد مسطحة. باستخدام مرحلة عالمية ، يمكن ضبط الإمالة في محورين ويمكن تصحيحها بسهولة تحت المجهر. تحافظ المرحلة المعدنية على برودة العينة تحت المجهر.

تتميز الغدد جيدا. يساعد التألق على التعرف بسهولة على محيط كل من الغدة والغطاء الواقي. تتم ملاحظة العينة من خلال مرشح FSE لعزل الغدد.

لاستخراج الحمض النووي الريبي ، يتم استخدام مرشح الأشعة فوق البنفسجية. يعد تحديد المواقع بدقة شديدة من الملقط الصغير ضروريا لعزل الغدة. يوصى بمعالجة الأداة في وضع السرعة المنخفضة.

مع الملقط الصغير ، يتم الاقتراب من الغدة ويتم وضع الأذرع على حدودها بواسطة عصا التحكم ، ويتم إغلاق الملقط الدقيق بدقة. ثم يتم رفع الغدة من الأنسجة المحيطة. بعد العزل الدقيق ، يمكن رؤية التجويف السليم وهو يقدم أنسجة الأوعية الدموية الأساسية.

ثم يتم نقل الغدة المعزولة إلى أنبوب PCR وترسبها في المخزن المؤقت المعد. للتحقق من صحة هذه الطريقة ، تم تحديد التعبير الجيني لبروتين الساق الذرية القصير ، TAP ، الذي يفرز في درجة السائل ، على أنه يمكن تضخيم الجين مباشرة من الغدد دون استخراج مسبق للحمض النووي الجيني. فقط عن طريق إضافة مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الأنسجة المعزولة.

تضمنت سلسلة التجارب غددا من صور nepenthe معالجة بشكل مختلف ، بالإضافة إلى عينات من أنسجة البشرة المحيطة بها. لكل تجربة إجمالية ، تم استخراج الحمض النووي الريبي. تمت ترجمة mRNA الذي تم الحصول عليه إلى CDNA المقابل عن طريق النسخ العكسي واستخدامه لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق.

لتضخيم التسلسل الجيني ذي الأهمية ، تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لمقارنة مستوى تعبير TLP في الغدد النيبينثية والبشرة. تظهر النتائج أن مستوى نسخ TLP أعلى في الغدد الإفرازية مقارنة بأنسجة البشرة في كل من nepenthes allotta و nepenthes miis كما هو موضح من خلال نسيج البشرة على نسبة أنسجة الغدة أقل من واحد لاختبار ما إذا كان الاتصال بالفريسة يمكن أن يحفز التعبير الجيني. تمت مقارنة مستويات نسخ TLP والصور والصور غير المعالجة التي تم تغذيتها بذبابة الفاكهة ميلان بعد اصطياد الفريسة.

أظهرت أنسجة البشرة تعبيرا أعلى عن TLP هنا. تمت مقارنة مستوى نسخة TLP للغدد وأنسجة البشرة والصورة المعالجة ل nepenthes miis. يشير التنظيم الإضافي لتعبير TLP في كلا النوعين من الأنسجة إلى أن إنتاج بروتينات سائل الإبريق يمكن أن يحدث بالفعل عن طريق الفريسة.

تشير نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أن التغذية تغير بشكل فعال تعبير TLP في كلا النوعين من الأنسجة ويمكن أن تغير نسبة التعبير بين الغدة والبشرة. لقد طورنا طريقة فعالة لحصاد التطهير من أنسجة الزائدة الدودية FA وعزلنا كمية كافية من mRNA لإجراء تجارب التعبير الجيني. باستخدام هذه الطريقة الجديدة التي طورناها ، ليس من الممكن فقط معالجة النسخ في الغدد الدودية ، ولكن بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا أيضا معالجة التمثيل الغذائي وكذلك البروتينات.