VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления

Общая цель здесь состоит в том, чтобы продемонстрировать методологию использования вирус-индуцированного сайленсинга генов для идентификации генов, участвующих в устойчивости нехозяев для достижения VIGs эндогенного растения. Целевой ген инокулировать растения nicotiana hamama вирусом табачной погремушки инжиром, несущим фрагмент целевого гена, получить и инокулировать нехостовые патогенные культуры, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, на ген молчащих листьев растений. Затем оцените зеленые флуоресцентные колонии патогенов, не являющихся хозяевами, под ультрафиолетовым светом в темноте.

Чтобы идентифицировать растения с подавленным геном, которые нарушают устойчивость к другим растениям, определите целевой ген путем секвенирования вставки в вирусном векторе. В целом, эта методология прямого генетического скрининга, опосредованного VIX, позволяет исследователям легко идентифицировать гены, участвующие в устойчивости растений к бактериальным патогенам. За короткий период времени мы поняли, что важность сочетания вирус-индуцированного подавления генов опосредует прямую генетику с патогенами, экспрессирующими GFP UV, для идентификации генов, ответственных за неустойчивость к ST.

Когда мы ранее проводили утомительный прямой генетический скрининг путем оценки гиперреакции, вызванной гибелью клеток и гибелью клеток, вызванной болезнью. Так семена никотианы Бен на беспочвенной почвенной почвенной смеси проращивают семена в ростовой камере. Через три недели пересадите рассаду в индивидуальные горшочки, выращивайте ее в теплице не менее двух-трех дней до появления вируса табачной погремушки.

Векторная инокуляция инжира постепенно размораживает замороженные стебли агробактерий, содержащих клоны кДНК. Intv два вектора в стерильных условиях инокулируют отдельные культуры агробактерий на Лурию. Тарелки Berti agro инкубируют пластины при температуре 28 градусов Цельсия до двух дней.

Вырастите четыре репликационные колонии для каждого клона, чтобы обеспечить достаточное количество инокуляции агробактерий для инокуляции двух растений. Инокулируйте TRV one в жидкую среду Luria berti. Соберите выращенные за ночь культуры с помощью центрифугирования, повторно суспендируйте бактерии в инокуляции, буферизуйте и инкубируйте в течение трех часов при комнатной температуре в шейкере со скоростью 50 об/мин.

После забора клеток центрифугированием измерьте оптическую плотность и суспензируйте бактериальные гранулы в пятимиллимолярном буфере MES pH 5,5 Затем инокулируйте T RV одну бактериальную культуру с наружным диаметром 600 0,3 в сторону оси трех-четырех листьев nicotiana hamama с помощью безыгольного шприца в месте одной инокуляции T RV. Проколите листья инокулюмом соответствующей T RV двумя колониями с помощью зубочистки в течение двух недель. Поддерживайте растения при низкой температуре с достаточным питанием, потому что энергичный рост важен для эффективного подавления экспрессии генов свиньями.

В качестве примера в данном эксперименте используется Pseudomonas senge PV томат T one. Возбудители должны нести плазмиду, которая может экспрессировать G-F-P-U-V выращивать штаммы PGE у королей быть жидкими, средними с добавлением 10 мкг на миллилитр. Рифампицин 50 микрограммов на миллилитр может принимать мицин при температуре 28 градусов Цельсия в течение 12 часов.

Соберите бактериальные культуры с помощью центрифугирования, затем подтвердите наличие зеленой флуоресценции с помощью длинноволновой ультрафиолетовой лампы в темноте. После двух промывок в стерильной воде восстановите суспензию клеток при нужной концентрации стерильной воды и отрегулируйте внешний диаметр 600. Затем инокулируйте соответствующие патогены на осевую сторону мишени.

Ген утепляет листья кругами диаметром около 1,5 сантиметра при необходимости. Одновременно тестируют несколько нехозяев патогенов на предмет их роста в целевом гене молчащих растений также включают векторный контроль для просмотра. Имплантируйте бактериальный нарост в период от двух до пяти дней.

Подвергайте инокулированные листья воздействию длинноволнового ультрафиолетового излучения в темноте. Обязательно надевайте средства защиты кожи и глаз. Следите за колониями бактерий в виде зеленых флуоресцентных пятен на осевой стороне листа на фоне красной флуоресценции, излучаемой поверхностью листа.

Проверьте зеленую флуоресценцию, излучаемую патогеном хозяина, который действует как положительный контроль. Наблюдайте за ростом возбудителя ежедневно в период от двух до пяти дней после прививки. Составьте список клонов, подавление которых привело к росту одного или нескольких нехозяйских патогенов.

Чтобы убрать ложные срабатывания с первого экрана. Повторите VIG для выбранных клонов и снова проверьте реакцию растений с генной глушителем на недорогостоящие патогены. Используйте колонийную ПЦР на выбранном клоне для амплификации вставки с использованием двух праймеров A TTB и A TB two в векторе T RV, двух или праймеров, гасящих сайт клонирования.

Запустите продукт ПЦР на геле ароса и проверьте амплификацию одного полосы. Затем секвенируйте вставку гена растения в T RV two vector, используя либо праймеры A TTB, либо праймеры, фланкирующие сайт клонирования. Выполните бласт с использованием последовательности и определите детали гена.

Обобщенный протокол для подавления большого количества генов с использованием вируса табачной погремушки на основе инжира у nicotiana. Хамана показана на этой блок-схеме. Некоторые из растений с геном молчания показали различные фенотипические изменения, включая задержку роста, пожелтение и фенотипы фотообесцвечивания.

Эти данные показывают зеленую флуоресценцию патогена, подвергшегося воздействию ультрафиолетового света в темноте перед инокуляцией растений, и их рост имплантируется через три дня после инокуляции, тот же лист, подвергшийся воздействию белого света, показан как контроль. В этом эксперименте отслеживается рост бактерий, экспрессирующих G-F-P-U-V на планах. Три нехоста.

С помощью патогенов был продемонстрирован процесс идентификации гена молчаливого растения, восприимчивого к нехозяевам, у диких растений nons silenced nicotiana hamama с иммунитетом. Эти возбудители не росли. Однако, по крайней мере, два не-хозяина патогена выросли на

замолчавших листьях NB sgt.One гена. Количественные данные о росте бактерий демонстрируют процесс идентификации генов молчащих растений с ослабленной устойчивостью к ST. Используя этот опосредованный инжиром подход прямой генетики, мы заставили замолчать около 5000 генов у nicotiana hamana и идентифицировали растения с устойчивостью к не-ST в течение примерно полутора лет.

В качестве примера показан рост патогена, не являющегося хозяином, в двух растениях с геном тишины, идентифицированных с помощью этого скрининга. Мы надеемся, что нам удалось понять, как проводить индуцированное вирусами подавление генов для сотен генов, а затем оценить замолчавшие растения, наблюдая за ростом недорогостоящих патогенов в планах, чтобы препарировать недорогостоящую устойчивость. Используя этот вирус-индуцированный ген, можно заставить замолчать сотни генов примерно за две-три недели, а затем оценить рост нелошадиных патогенов, помеченных GFP UV, примерно за два-три часа в день, в течение двух-пяти дней.