الفصل الآلي لل

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم مساهمات الاستعمار وما يصاحبه من تلف في بدء الاستجابات المناعية الفطرية في ديدان *C. elegans*. ويتم تحقيق ذلك من خلال تعريض مجموعة متزامنة من ديدان *C. elegans* البالغة اليافعة لبكتيريا *Pseudomonas aeruginosa* التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر GFP، مما ينتج عنه مجموعة من الديدان المستعمرة متباينًا بواسطة الممرض. بعد الغسل، يتم فصل المجموعات المستعمرة بشكل متفاوت إلى مجموعات نقية، مع التركيز على الطرفين المتضادين: الديدان المستعمرة بالكامل والديدان غير المستعمرة.

بعد ذلك، يتم استخلاص الـ RNA من هذه المجموعات وتقييم التعبير الجيني المناعي مقارنة بالديدان التي نمت على بكتيريا e coli غير الممرضة. ومن أجل فحص العلاقة بين الاستجابة المناعية والاستعمار البكتيري، تم الحصول على نتائج تظهر أن الاستجابة المناعية الفطرية لـ sea elegance تجاه p arosa يمكن فصلها عن استعمار الممرض. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالنهج الأخرى لدراسة بدء الاستجابة المناعية في sea elegance في أنها تعالج التباين في العدوى ضمن مجموعات الديدان، مما يسمح لنا بفصل الجوانب المختلفة لعملية العدوى.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المناعة الفطرية، مثل ما هو أساس بدء الاستجابات المناعية الفطرية، وذلك بطريقة عالية الإنتاجية. ما هو تأثير التعديلات الجينية أو البيئية المختلفة على القدرة على مقاومة استعمار الممرضات؟ للبدء، قم بتنمية الديدان على عدة أطباق وسط نمو النيماتودا (NGM) الملقحة ببكتيريا e coli حتى تصل العديد من الديدان إلى مرحلة البلوغ.

بعد ذلك، تُعالج الحيوانات الحاملة للبويضات بمحلول تحضير البويضات للحصول على مزرعة متزامنة. تالياً، تُوضع البويضات على عدة أطباق NGM بقطر 60 مليمتر ملقحة بالبكتيريا بكثافة تتراوح تقريباً بين 150 إلى 200 بيضة لكل طبق.

سيلزم توفير 15 إلى 20 طبقاً كحد أدنى للحصول على عدة آلاف من الديدان. وبالنسبة لتجربة الفرز، يجب على المستخدمين زيادة النطاق باستخدام أطباق ذات قطر أكبر تحتوي على عدد أكبر من البيوض في كل طبق إذا كانت هناك حاجة إلى أعداد أكبر من الديدان. تُحضن الأطباق عند 20 °C لمدة يومين حتى تصل الديدان إلى مرحلة L4 أو مرحلة البلوغ المبكر.

في اليوم التالي لتحضير البيض، قم بتلقيح مستنبت POSA الذي يعبر عن GFP، وهو PA 14 GFP، في 2 mL من وسط Kings B الذي يحتوي على المضاد الحيوي. حضن المستنبت عند 37 °C مع الرج طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بنشر مستنبت PA 14 GFP على العدد المطلوب من أطباق القتل البطيء اللازمة للمقايسة في كل طبق بتري بقطر 150 mm.

قم بسحب 75 إلى 100 µL من المزرعة المشبعة ووزعها بالتساوي. وباستخدام ناشر زجاجي معقم، قم بتحضين الأطباق عند 37 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 24 ساعة. أخرج الأطباق التي تحتوي على PA 14 GFP من المحضنة واتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

وفي هذه الأثناء، لجمع الديدان التي نمت على أطباق NGM، أضف كمية صغيرة من محلول M nine المنظم تكون كافية لتغطية الطبق. قم بتدوير الطبق برفق وانقل السائل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. اترك الديدان تترسب في القاع وأزل السائل الزائد قبل نقل الديدان إلى أطباق PA 14 GFP في أقل حجم ممكن من السائل؛ فعند استخدام أطباق بقطر 150 millimeter، يمكن وضع عدة مئات من الديدان في طبق واحد.

يتم تحضين الأطباق عند 25 °C لمدة تتراوح من 18 إلى 21 ساعة للديدان البالغة اليافعة المعرضة لـ p arosa. تمثل هذه الفترة النافذة الزمنية التي تظهر التوزيع الأمثل للحيوانات المستعمرة مقابل غير المستعمرة؛ وقبل إجراء فرز العينات، يجب التأكد من أن الجهاز يعمل بشكل صحيح. تم توضيح الخطوات الأساسية هنا ويمكن الحصول على التفاصيل عبر الإنترنت.

اضبط ضغط صمام الغمد على 5 PSI تقريباً للتحقق من أن معدل تدفق سائل الغمد مناسب. ضع أنبوباً مخروطياً سعة 15 milliliter أسفل الموزع. افتح صمام الغمد وأغلق صمام الفرز.

أمسك الأنبوب أسفل الموزع لمدة 60 ثانية. يجب أن يكون الحجم في الأنبوب من 9 إلى 10 milliliters. إذا كان الحجم خارج هذا النطاق.

اضبط ضغط صمام الغلاف وفقًا لذلك لضمان أن معدل تدفق سائل الغلاف سيسمح بفرز دقيق. اختبر معدل الفرز عن طريق إغلاق صمام الغلاف أولاً، ثم أضف حوالي 25 milliliters من محلول الجسيمات الضابطة إلى الخزان.

قم بتشغيل صمام الغلاف وصمام العينة من خلال برنامج الكمبيوتر. انتقل إلى وضع التحكم في الجسيمات وانقر على "acquire". تأكد من أن معدل تدفق الجسيمات يتراوح تقريباً بين خمسة إلى ثمانية جسيمات في الثانية، مع كون زمن الطيران يقارب عرض الجسيم الذي يبلغ 40 micrometer.

سيضمن ذلك مرور كائن واحد فقط بحجم 40 micron في المرة الواحدة. وإذا كانت القيم خارج هذا النطاق، فيجب ضبط الإعدادات وفقاً لذلك. وباستخدام M nine buffer، يتم غسل الديدان في أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter، وتُترك الديدان البالغة لتترسب في قاع الأنبوب بفعل الجاذبية، ثم يُزال الطافي.

املأ الأنبوب بمحلول M nine المنظم الطازج. كرر هذه العملية من ثلاث إلى أربع مرات. تؤدي هذه الخطوة إلى إزالة نسبة كبيرة من اليرقات بالإضافة إلى البكتيريا الزائدة وتستغرق حوالي 10 دقائق.

أضف الديدان إلى خزان فارز الديدان الذي يحتوي على قضيب تحريك صغير يقوم بالخلط بلطف. اضبط كسب الإشارة الأولي من خلال ضبط أنبوب المضاعف الضوئي الأخضر على 600 وأنابيب المضاعف الضوئي الحمراء والصفراء على 200. ابدأ في الحصول على البيانات لضبط الإعدادات.

استهدف معدل فرز يتراوح بين 25 إلى 30 حدثاً أو دودة في الثانية. إذا كان معدل العدد مرتفعاً جداً، خفف الديدان في الخزان باستخدام M nine، مع ضبط المحلول المنظم وفقاً لذلك.

إذا كان المعدل منخفضاً جداً، أضف المزيد من الديدان في حجم صغير من M nine. إذا كانت التجربة تتطلب فصلاً صارماً للغاية بين الديدان المستعمرة وغير المستعمرة، فقم بضبط فحص التطابق (coincidence check) على الوضع "نقي" (pure). يضمن ذلك أنه في حال وجود جسمين قريبين جداً من بعضهما البعض أو في القطرة نفسها، تقوم الآلة برفض القطرة.

بدلاً من جمع العينة لفرز الجمهرة المستهدفة، قم برسم بوابات حول المحور الذي يشير إلى الحجم وشدة الفلورة. يجب تحديد قيم البوابات الفلورية تجريبياً. بعد ذلك، ضع طبقاً متعدد الفجوات أو طبق بتري أسفل الموزع لجمع الديدان.

ثم افتح صمام الفرز لبدء فرز الديدان. اجمع مجموعة صغيرة من الحيوانات للتحقق تحت المجهر من أن المجموعة التي تم فرزها هي المجموعة المستهدفة. وإذا لم يكن الأمر كذلك، فقم بتعديل معايير البوابة (gating parameters) وفقاً لذلك وتابع عملية جمع العينات.

عندما تتعرض ديدان sea elegance متطابقة جينياً ومتوافقة في العمر لبكتيريا posa المعبرة عن GFP، ينتج عن ذلك توزيع واسع في مستويات الاستعمار، وقد تم تحقيق فصل فعال للديدان غير المستعمرة عن الديدان المستعمرة باستخدام جهاز فرز الديدان. وعلى عكس الديدان غير المستعمرة، تظهر الديدان المستعمرة علامات واضحة مثل الخمول وانخفاض معدل التبرز. وقد يكون السبب الأخير هو ما يجعل الديدان التي استعمرتها P arosa تواجه صعوبة في التخلص من العدوى.

تم تحفيز أربعة جينات بشكل مشابه للتعرض لـ P arosa بغض النظر عن حالة استعمار الديدان، واستُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي الكمي (quantitative R-T-P-C-R) لقياس تعبير هذه الجينات. ومن المعروف أن هذه الجينات الأربعة جزء من الاستجابة المناعية لـ C. elegans. يشفر Lys two إنزيم الليزوزيم 2، وهناك جينان غير مصنفين يستجيبان تحديداً للعدوى، حيث يساهم أحدهما أيضاً في مقاومة العدوى، بينما يستجيب PGP five للعدوى وكذلك للإجهاد الناتج عن المعادن الثقيلة.

تؤكد هذه النتائج ما نُشر سابقاً من أن الاستعمار وما يصاحبه من تلف ليس ضرورياً لإحداث استجابة مناعية. وبدلاً من ذلك، تشير النتائج إلى أن الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض هي الإشارة؛ حيث تُظهر البيانات أن PGP five يتم تحفيزه في الحيوانات غير المستعمرة، والتي لا يُتوقع تعرضها لتلف واسع النطاق، مما يشير إلى وجود تداخل في البرامج التنظيمية التي تتحكم في الاستجابات المناعية واستجابات الإجهاد العامة في *C. elegans*.

يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى جديدة حول بدء الاستجابات المناعية في دودة sea elegance، ولكن يمكن تطبيقها أيضاً على تساؤلات أخرى مثل تأثيرات الظروف البيئية أو التعديل الوراثي على الاستعمار أو التنافس بين الممرضات المختلفة بالإضافة إلى عمليات العدوى. كما يمكن تطبيق هذه الطريقة لتتبع تفاعلات أخرى للديدان مع بيئتها مثل ابتلاع أو عزل المستقلبات أو المواد الكيميائية. وباتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام المجموعات السكانية التي تم فرزها والمستهدفة لمجموعة متنوعة من الأغراض التي تتجاوز التعبير الجيني.

وتشمل هذه العمليات جمع حيوانات حية لإجراء اختبارات العدوى أو البقاء أو التجارب السلوكية اللاحقة. توفر هذه التقنية وسيلة مفيدة لدراسة آثار التعرض لمسببات الأمراض والاستعمار الميكروبي على المناعة الفطرية وsea elegance.I.