배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

이 절차의 전반적인 목표는 면역학 분석 및 백신 접종 실험을 위해 올바르게 접힌 정제된 인플루엔자, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 표면 당단백질을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 인플루엔자 유전자를 운반하는 재조합 BMid를 클로닝한 다음 재조합 baula 바이러스를 생성함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이러한 재조합 바울라 바이러스를 사용하여 곤충 세포에서 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 것입니다.

다음으로, 재조합 단백질은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양 상등액에서 정제합니다. 마지막 단계는 우수한 품질과 생물학적 기능을 보장하기 위해 이러한 단백질을 특성화하는 것입니다. 궁극적으로 재조합 단백질은 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질에 대한 면역 반응을 조사하는 데 사용됩니다.

예를 들어, HA one의 박테리아 발현과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 면역학적 분석을 위해 전체 바이러스 제제를 사용하는 것과 달리 정제된 항원이 교정 접히고 생물학적 활성을 유지한다는 것입니다. 이 시약을 사용하면 헤마글루티닌 단백질과 비뉴라미니다제 단백질에 대한 면역 반응을 측정할 수 있습니다. 단지 층류 후드 플레이트에서 무균으로 작동하는 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이 재조합 바울라 바이러스의 생성으로 이 프로토콜을 시작하고, 200, 평방 센티미터당 000 세포의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 있는 9개의 곤충 세포를 SF

그리고 CO2가 없는 섭씨 28도의 인큐베이터에서 20분 동안 앉아 봅시다. 그런 다음 2마이크로그램의 재조합 백 미드를 100마이크로리터의 Trico Leia 무릎 중간 제형 HINK 또는 TNM fh와 혼합합니다. 그런 다음 6마이크로리터의 형질주입제와 100마이크로리터의 TNM FH 곤충 배지를 혼합합니다.

두 부피의 혼합물을 부드럽게 결합하고 트랜스펙션 혼합물을 20분 동안 그대로 둡니다. 실온에서 하나의 모의 transfection을 대조군으로 포함하며, 여기에는 transfection 시약이 포함되지만 DNA는 포함되지 않습니다. 도금된 SF 9개 세포에서 SNAT를 제거하고 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액을 함유한 2ml의 무혈청 TNM FH 배지로 교체합니다.

transfection 혼합물의 전체 부피를 세포에 추가하고 6웰 플레이트를 5초 동안 조심스럽게 흔듭니다. CO2가 없는 섭씨 28도의 인큐베이터에서 6시간 동안 배양합니다. 6일 동안 동일한 조건에서 플레이트를 배양하기 전에 배지를 새로운 전체 TNM FH 배지로 교체하십시오.

때때로 현미경으로 세포를 확인하십시오. 감염된 세포는 일반적으로 더 크게 나타납니다. 더 둥글게 핵이 커지고 분리되기 시작합니다.

형질주입 6일 후 2000G에서 실온에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상등액에는 재조합 baula 바이러스가 포함되어 있으며 즉시 작업 재고를 생성하는 데 사용되거나 수년 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. SDS 페이지 및 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 작업 원료를 준비합니다.

SF 9 세포는 황반 바이러스의 성장을 매우 잘 지원합니다. 그러나 다량의 재조합 단백질을 분비하는 능력은 제한적입니다. 따라서 우리는 다른 곤충 세포주를 사용합니다.

분비된 재조합 단백질의 발현을 위한 High five 세포. 이 세포는 balo virus가 높은 역가로 성장하는 것을 지원하지 않지만 매우 높은 분비 능력을 가지고 있습니다. 격일로 T 175제곱센티미터 플라스크 통로의 SFX 곤충 세포 배양 배지에서 하이파이브 세포를 성장시킵니다.

1:3 비율로 나눕니다. 200ml 발현 배양을 위해 5개의 융합 플라스크를 성장시켜 상위 5개 세포를 수확하고 감염시킵니다. 먼저 플라스크를 두드려 하이파이브 셀을 분리합니다.

세포 현탁액을 수집하여 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 1200G에서 7분 동안 튜브를 돌립니다. 디캔팅으로 상등액을 제거하고 리서스로 펠릿을 결합하여 15 밀리리터의 P 3 스톡에 현탁시킵니다.

세포를 플로우 후드에 15분 동안 그대로 두십시오. 200ml의 고클론 SFX 배양 배지를 깨끗하고 멸균된 1000ml 셰이커 플라스크로 옮깁니다. 그런 다음 P 3 셀 현탁액을 멸균 알루미늄 호일이 있는 셰이커 플라스크 씰로 옮긴 후 70RPM 및 28°C에서 72-96시간 동안 진탕합니다.

감염 후 72-96시간에 하이파이브 세포 발현 상등액에서 재조합 단백질을 수확합니다. 배양 상등액을 500ml 원심분리 버킷으로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 5, 500G에서 회전합니다.

그 동안 셰이커 플라스크를 이중 증류수로 세 번 헹굽니다. 다음 피펫. 3밀리리터의 니켈 수지가 50밀리리터 튜브에 슬러리되어 배양 200밀리리터당 45밀리리터의 PBS가 있습니다.

원심분리 후 3000G와 실온에서 10분 동안 회전하기 전에 잘 흔듭니다. PBS를 디캔팅하고 펠릿을 보관하십시오. 곤충 세포 상등액을 니켈 수지 펠릿과 혼합하고 이미 헹궈진 셰이커 플라스크에 옮깁니다.

섭씨 4도에서 2-4시간 동안 흔들면서 배양합니다. 다음으로, 10ml 폴리프로필렌 컬럼을 지지 스탠드에 클램프로 장착합니다. 두 캡을 모두 제거하고 컬럼 아래에 비커를 놓아 흐름을 수집합니다.

셰이커 플라스크를 배양한 후 상등액 슬러리 혼합물을 컬럼으로 옮기기 시작합니다. 그것은 니켈 수지를 유지하고 상등액만 흐를 것입니다. 전체 볼륨을 컬럼 위로 넘깁니다.

15ml의 세척 버퍼로 수지를 네 번 세척합니다. 세척 버퍼가 컬럼에서 배출되도록 하고 캡으로 아래쪽을 닫습니다. 엘루시안 완충액 2ml를 넣고 5분 동안 그대로 둡니다.

기둥을 열고 eit를 수집하고 가능하면 젖은 얼음 위에 보관하십시오. 이 작업을 세 번 더 반복합니다. 고농도의 단백질을 함유한 EIT는 일반적으로 완충액을 교환하고 단백질을 먼저 농축하기 위해 흔들면 거품이 나타나며, 3000G 및 섭씨 4도의 PBS로 15ml 초여과 원심분리 장치를 20분 동안 자유 스핀합니다.

플로우 스루를 버리고 EIT를 스핀 컬럼에 로드합니다. 컬럼을 5ml의 멸균 얼음처럼 차가운 PBS로 채운 후 동일한 조건에서 60분 동안 회전합니다. 흐름을 다시 배출하고 15ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 다시 채우고 추가로 60분 동안 회전합니다.

이 절차를 한 번 더 반복한 다음 고농축 재조합 단백질을 나타내는 완충액 교환 농축액을 수집합니다. 농축액을 항상 얼음에 보관하십시오. 스핀 컬럼을 400마이크로리터의 멸균 얼음처럼 차가운 PBS로 헹구고 이를 농축액에 첨가합니다.

그런 다음 단백질은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 특성화할 수 있습니다. ENUE 및 상하이 균주에 의해 발현된 HA 및 NA 단백질은 상하이에서 수집된 인플루엔자 A의 경우 리터당 0.2mg에서 인플루엔자의 경우 리터당 0.7mg에 이르는 중간 수준의 발현 수준을 보였습니다. 두 균주의 인플루엔자 A, 뉴라미니다아제 또는 NA 분자에 수집된 A는 상하이에서 수집된 인플루엔자 A의 경우 리터당 0.2mg에서 인플루엔자 A의 경우 리터당 0.7mg에 이르는 중간 발현 수준을 보였습니다.

4가지 단백질 제제 모두 불순물이 거의 또는 전혀 없었으며 ha's는 nas보다 순도가 높았으며, 이는 발현 수준으로 설명할 수 있습니다. 상하이 HA에서 수집된 인플루엔자 A는 광범위 중화 줄기 반응성 인간 단클론 항체 CR 9 1 1 4와 함께 ELI SA를 사용하여 추가로 분석되었습니다. 여기에서 파란색으로 표시된 바와 같이, 이 단클론 항체는 스톡 도메인의 민감한 확인 항원결정기에 결합하며 여기에서 이 도메인의 올바른 접힘을 위한 프로브로 사용됩니다.

항체는 490나노미터에서 흡광도가 증가한 것으로 입증된 우수한 결합력을 보여주며, 이는 HA가 실제로 올바르게 접혔다는 확신을 줍니다. 두 번째로, 수득된 단백질이 아형 7 기원의 헤마글루티닌으로서의 동일성을 확인하기 위해 7형 마우스 다클론 혈청의 항헤마글루티닌을 사용한 Eliza를 수행하였다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 재조합 인플루엔자 바이러스, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 방법을 잘 이해하게 되었습니다.

이 과정은 다른 바이러스 또는 세포막 단백질의 발현에도 유용할 수 있습니다. 당신의 실험에 행운을 빕니다.