Name: Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Leer de synthese van een stabiele eiwithydrogel via split-intein-gemedieerde trans-splicing. Deze methode maakt eiwitimmobilisatie mogelijk in een poreus, gehydrateerd milieu zonder chemische modificaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr David Tirrell (Caltech) erkennen voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, dr. Tom Muir (Princeton universiteit) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pET30-Cuta-Tip1 10, en Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pJD757 13 . Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation LOOPBAAN, US Air Force YIP en Norman Hackman Geavanceerde onderzoeksprogramma.

1. Plasmideconstructie OPMERKING: Alle genen werden geamplificeerd onder standaard PCR-reacties gebruik Phusion High-Fidelity DNA Polymerase per specificaties van de fabrikant. Primers gebruikt voor klonering zijn eerder 9 beschreven. Alle constructen zijn vermeld in tabel 1. <ol><li> Om Cuta-NpuN (N, tabel 1) te genereren: <ol><li> PCR versterken Cuta en NpuN genen van plasmiden pET30-Cuta-Tip1 10 en KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectievelijk, met de juiste primers. </li><li> Digest deze fragmenten met de geschikte restrictie-enzymen en invoegen deze fragmenten achtereenvolgens in de pET26b vector tussen de T7 promotor en een C-terminaal tag 6xHistidine N (figuur 2A) genereren. </li></ol></li><li> Genereren NpuC-S-Cuta (C, tabel 1): <ol><li> PCR Amplify NpuC, Cuta en S fragmentatiet [AG 3 (PEG)] 10 van plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-Cuta-Tip1 10 en pQE9 AC 10 ATRP 12, respectievelijk, met de juiste primers. </li><li> Digest deze fragmenten met de geschikte restrictie-enzymen en na elkaar plaats deze fragmenten in de vector pET26b tussen T7-promoter en een C-terminale naar C 6xHistidine (figuur 2B) genereren. </li></ol></li><li> : Tot NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, tabel 1) genereren <ol><li> PCR Amplify Cuta behulp van primers die een SH3 lig (PPPALPPKRRR) en een flexibele linker (GGGGS) 2 tot fragment SH3 lig-Cuta genereren. </li><li> Vervang de Cuta gen uit C met fragment SH3 lig-Cuta. </li></ol></li><li> Om SH3-GFP (Tabel 1) genereren: <ol><li> Versterken het SH3-gen uit plasmide pJD757 13 via degeschikte primers. </li><li> Strijk dit fragment aan het GFP-gen en steek deze in de pET26b vector tussen de T7 promoter (figuur 2C) en een C-terminale 6xHistidine tag. </li></ol></li></ol> 2. Eiwitexpressie <ol><li> Transformeren 50 pl chemisch competente Escherichia coli BL21 (DE3) met het geschikte expressieplasmide. </li><li> Na transformatie, serieel verdunnen deze cellen en plaat ze op Luria-Bertani (LB) / agarplaten die 50 ug / ml kanamycine. </li><li> Incubeer de platen die getransformeerde cellen bij 37 ° C voor ~ 15 uur. </li><li> Na incubatie, kies een plaat die 50-100 kolonies bevat en resuspendeer alle kolonies in 5 ml LB-bouillon. </li><li> Transfer suspensie 1 L LB-bouillon die kanamycine (50 ug / ml) en cellen groeien bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. Bewaken van de absorptie bij 600 nm (OD 600). Grow cultuur tot OD 600 ~ 0.8. <ol><li> Voor C-en C-SH3 LIG, induceren eiwitexpressie door toevoeging isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan de kweek (1 mM eindconcentratie) en incubeer de kweek bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden bij 250 rpm. </li><li> Voor N en SH3-GFP Koel de cultuur ~ 18 ° C door onderdompeling van de kolf in een ijs-waterbad ~ 5 minuten. Induceren eiwit expressie door IPTG toe te voegen aan de cultuur (1 mM eindconcentratie) en incubeer de cultuur bij 18 ° C gedurende 14-18 uur onder schudden bij 250 rpm. </li></ol></li><li> Na eiwitexpressie centrifugeer de kweken bij 6000 g gedurende 20 min bij 4 ° C om de pellet te verzamelen. WINKEL celpellet bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> Zuivering van N (denaturerende omstandigheden) <ol><li> Resuspendeer celpellets in buffer A (Tabel 2) en 10 ml / g nat pellet. </li><li> Immerse de pellet suspensie in een ijs-waterbad en verstoren cellen door sonicatie (Amp 10, met 1 sec puls en 6 sec pauze gedurende 1 minuut). </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in buffer DA (bevattende 8 M ureum) en de suspensie gecentrifugeerd bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Passeren de bovenstaande vloeistof op een 5 ml Ni-nitrilotriazijnzuur (NTA) kolom vooraf in evenwicht met buffer DA. </li><li> Waskolom met 30 mi buffer DA gesupplementeerd met 45 mM imidazool. Elueer gezuiverde eiwit met 20 mi buffer DA aangevuld met 150 mM imidazool. </li><li> Verlaag de ureumconcentratie in het proteïne monster &lt;1 mM van een van de volgende methoden aangegeven in 3.1.7.1 of 3.1.7.2: <ol><li> Dialyze eiwit in DPBS buffer (tabel 2) bij 4 ° C geïncubeerd met buizen met &lt;20 kDa. </li><li> Centrifuge gezuiverd eiwit in een 30 &amp; #160; kDa ultrafiltratie kolom centrifugeren op 2800 x g, 4 ° C totdat het volume kleiner dan 1 ml. Voeg 14 ml DPBS buffer aan de kolom om het eiwit monster te verdunnen. Herhaal het centrifugeren / verdunningsstappen nog drie keer. </li></ol></li><li> Na bufferuitwisseling, voeg dithiothreitol (DTT) het gezuiverde eiwit (laatste 2 mM) en concentreer eiwit ~ 100 mg / ml door centrifugeren door een 30 kDa ultrafiltratie kolom centrifugeren op 2800 x g, 4 ° C. </li><li> Aliquot de geconcentreerde proteïneoplossing en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Zuivering van C en C-SH3 lig (native voorwaarde) <ol><li> Resuspendeer celpellets in buffer B (pH 6,0) (Tabel 2) aangevuld met 1 x proteaseremmer cocktail aan 10 ml / g nat pellet. Gebruik zure buffer om proteolytische afbraak van het doeleiwit minimaliseren. </li><li> Verstoren celsuspensie door sonicatie zoals beschreven in 3.1.2. Centrifugeer de lysaten bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en bewaar het supernatant. </li><li> Pass oplosbare lysaat through 5 ml column Ni-NTA eerder geëquilibreerd met buffer B. </li><li> Was de kolom met buffer B gesupplementeerd met 45 mM imidazool, en elueer het doeleiwit in 20 ml buffer B aangevuld met 150 mM imidazool. </li><li> Voor C, doorgaan naar stap 3.2.6. Voor C-SH3 lig, het uitvoeren van een aanvullende ionenwisseling zuiveringsstap om gedeeltelijk afgebroken eiwit te verwijderen zoals aangegeven in stappen 3.2.5.1 naar 3.2.5.3 <ol><li> Verminder NaCl-concentratie in C-SH3 lig tot &lt;1 mM volgens de in 3.1.7 beschreven procedure. </li><li> Laad het doeleiwit op een 5 ml anionenwisselaar kralen agarosematrix kolom vooraf geëquilibreerd met natriumfosfaatbuffer (50 mM, pH 7.0). </li><li> Elueer doeleiwit uit de kolom door het uitvoeren van een gradiënt van een oplossing die 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer een oplossing met dezelfde buffer aangevuld met 1 M NaCl. Neem monsters tijdens eiwitelutie en zwembad monsters met de hoogste zuiverheid gebaseerd op natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Bufferuitwisseling het gezuiverde eiwit in DPBS buffer, zoals beschreven in 3.1.7. </li><li> Voeg DTT aan het gezuiverde eiwit (eindconcentratie 2 mM) en concentreer het eiwit -100 mg / ml met een 30 kDa ultrafiltratie spin-kolom zoals beschreven in 3.1.8. Aliquot en bewaar geconcentreerd eiwit bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Zuivering van SH3-GFP <ol><li> Resuspendeer celpellets behulp Buffer A bij 10 ml / g nat pellet. </li><li> Verstoren pellet schorsing door sonicatie zoals beschreven in 3.1.2. </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof. </li><li> Passeer de supernatant (oplosbare lysaat) door middel van een 5-ml-kolom Ni-NTA vooraf in evenwicht metBuffer A. </li><li> Waskolom met 30 ml Buffer A, aangevuld met 45 mM imidazool. Elueer gezuiverde eiwit met 20 ml Buffer A, aangevuld met 150 mM imidazool. </li><li> Bufferuitwisseling het gezuiverde eiwit in DPBS buffer met behulp van een aanpak vergelijkbaar met die in 3.1.7 beschreven en concentreer het eiwit ~ 150 mg / ml met behulp van een 30 kDa ultrafiltratie spinkolom zoals beschreven in 3.1.8. </li><li> Aliquot en bewaar gezuiverd eiwit bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> SDS-PAGE-analyse van gezuiverde monsters die Cuta <ol><li> Verdun elk gezuiverd eiwit in tweemaal gedestilleerd water om de concentratie van NaCl tot ~ 1 mM verminderen. Op dit NaCl concentratie meeste Cuta trimeer eiwitten lopen als monomeren op SDS-PAGE gels. </li><li> Meng monsters met 2x SDS-monsterbuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% Glycerol, 10% w / v SDS, 0,1% w / v broom-fenol blauw, 2% β-mercaptoethanol), geïncubeerd bij 95 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Laad de samselen op een 12% SDS-PAGE gel. Voer elektroforese bij een constante spanning van 200 V ~ 50 minuten. </li><li> Let op eiwit in de gels door kleuring met Coomassie brilliant blue R250 na de standaard protocollen (figuur 1C). </li></ol></li></ol> 4. Hydrogel Vorming Opmerking: het monster hydrogels in deze studie bevatten 1,6 mM van elk hydrogel bouwsteen tenzij anders vermeld. De eiwitconcentratie levert een zachte en stabiele hydrogel. VOORZICHTIG: Natriumazide (NaN3) wordt de hydrogel toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% w / v om bacteriële contaminatie te voorkomen. NaN 3 is zeer giftig en moet met uiterste zorg worden behandeld zoals aangegeven in het Material Safety Data Sheet. <ol><li> Bereken het volume van elk van de geconcentreerde eiwitten die nodig zijn om een ​​eindconcentratie van 1,6 mM bereiken in een 100 ui monster hydrogel. Bijvoorbeeld: Concentratie van N:100 mg / ml Moleculair gewicht van N: 26,3 kDa (zie tabel 1) Gewenste Volume: 100 pl gewenste concentratie: 1,6 mm <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Een 100 pl hydrogel (1,6 mM), meng C (x pi volume berekend volgens 4.1) met 5% NaN3 (10 pi), 100 mM DTT (5 ui) en N (y ui volume berekend volgens 4.1) in een 2 ml glazen flacon. </li><li> Voeg DPBS buffer ((85 - x - y) pi) aan de flacon om een eindvolume van 100 pl te bereiken en alle componenten door een wervelende beweging met een pipetpunt handmatig mengen. Opmerking: De oplossing wordt zeer viskeus na mengen. </li><li> Centrifugeer het mengsel gedurende 2 min bij 8000 xg om de luchtbellen te verwijderen. </li><li> Incubeer het mengsel bij kamergedurende een nacht om de intein trans-splicing reactie tot voltooiing te komen. Bevestig hydrogel formatie door te draaien buis ondersteboven. De eiwitten zullen stromen als een hydrogel wordt gevormd. </li><li> Schat de intein trans-splicing opbrengst door eerst monsters (0,5 pi elk) vóór stap na stap 4.2 en 4.5 op een SDS-PAGE gel verzameld, zoals beschreven in 3.4 (figuur 1C). </li></ol> 5. Immobilisatie van GFP via Docking Protein (DP) en Docking Station Peptide (DSP) Interaction <ol><li> Om een 50 ul-GFP gefunctionaliseerde hydrogel (1.2 mM) te maken, combineer C-SH3 lig (x pi, berekend volgens 4.1) en SH3-GFP (y pi, berekend volgens 4.1) op 1:1 molverhouding in een 1,7 ml microcentrifugebuis en incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 5% NaN3 (5 pi), 100 mM DTT (2,5 pl), (42.5 - x - &lt;em&gt; y) gl DPBS dezelfde buis. Add N (y pi, berekend volgens 4.1) naar een 1:1 molverhouding van N-en C-SH3 lig te bereiken. Meng het monster met behulp van een pipet met een wervelende beweging. </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 8000 xg gedurende 2 minuten en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur overnacht in het donker. Een hydrogel inkapselen SH3-GFP vormen tijdens incubatie. </li></ol> 6. Het gebruik van 1,6 mM Hydrogel als immobilisatie matrix voor enzymatische reactie in Organic Solvent <ol><li> Gebruik HRP als model enzym. Bereid een voorraad oplossing van HRP (28 mg / ml of 0,63 mM) in DPBS. </li><li> Om een 30 ul hydrogel (1,6 mm) insluiten van HRP maken, combineren C (x pi, berekend volgens 4.1) met HRP (2 pi), 5% NaN 3 (3 pl) en DTT (1,5 pi van 100 mM) in een 1.7 ml centrifugebuis. </li><li> Add N (y &lt;/ Em&gt; ul, berekend volgens 4.1) en DPBS (23.5 - x - y) ul. Meng met een pipet tip met een wervelende beweging. </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 8000 xg gedurende 2 minuten en incubeer bij kamertemperatuur gedurende een nacht. LET OP: de regenten gebruikt voor de volgende activiteit test zijn zeer giftig. Gebruik specifieke veiligheidsaanbevelingen door de bijbehorende Material Safety Data Sheets. </li><li> Voor enzymatische reactie onderdompelen hydrogel in 1 ml reactiecoctail die N, N-dimethyl-p-fenyleendiamine (5,8 mM), fenol (5.8 mM) en tert-butylhydroperoxide (2,9 mM) in n-heptaan 14. Handmatig verstoren de gel met behulp van een pipet om het contactoppervlak van de hydrogel en het oplosmiddel verhogen. </li><li> Detect HRP product, een indofenol type kleurstof, door de optische absorptie van monsters op verschillende tijdstippen bij 546 nm in een plaatlezer (Figuur 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

<ol><li>Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Engineering+in+the+Development+of+Functional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).</li>
<li>Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+protein+trans-splicing+by+a+naturally+split+DnaE+intein+from+Nostoc+punctiforme%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme.</a> FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).</li>
<li>Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+naturally+split+Npu+DnaE+intein+exhibits+an+extraordinarily+high+rate+in+the+protein+trans-splicing+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction.</a> FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+implications+for+heavy+metal-induced+reversible+assembly+and+aggregation+of+a+protein%3A+the+case+of+Pyrococcus+horikoshii+CutA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA.</a> FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).</li>
<li>Sawano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+basis+for+the+stabilities+of+three+CutA1s+from+Pyrococcus+horikoshii%2CThermus+thermophilus%2C+and+Oryza+sativa%2C+with+unusually+high+denaturation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures.</a> Biochemistry. 47, 721-730 (2008).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyper-thermostability+of+CutA1+protein%2C+with+a+denaturation+temperature+of+nearly+150+degrees+C.%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C.</a> FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).</li>
<li>Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+erosion+rate+of+artificial+protein+hydrogels+through+control+of+network+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology.</a> Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).</li>
<li>McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+directed+syntheses+of+new+polymeric+materials.+Expression+of+artificial+genes+encoding+proteins+with+repeating+-%28AlaGly%293ProGluGly-+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements.</a> J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).</li>
<li>Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intein-triggered+artificial+protein+hydrogels+that+support+the+immobilization+of+bioactive+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).</li>
<li>Ito, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+hydrogel+formation+driven+by+protein-peptide-specific+interaction+and+chondrocyte+entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment.</a> Biomaterials. 31, 58-66 (2010).</li>
<li>Lockless, S. W., Muir, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+protein+splicing+utilizing+evolved+split+inteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).</li>
<li>Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+an+artificial+protein+hydrogel+through+leucine+zipper+aggregation+and+disulfide+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation.</a> Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).</li>
<li>Dueber, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+protein+scaffolds+provide+modular+control+over+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.</a> Nat. Biotechnol. 27, (2009).</li>
<li>Bruns, N., Tiller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+network+as+nanoreactor+for+enzymes+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents.</a> Nano Lett. 5, 45-48 (2005).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+gelation+of+an+amino+acid-based+amphiphile%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Water gelation of an amino acid-based amphiphile.</a> Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).</li>
<li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tandem+modular+protein+based+reversible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels.</a> Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+specific+interaction+of+lysine-containing+proline-rich+peptides+with+the+N-terminal+SH3+domain+of+c-Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk.</a> Structure. 3, 215-226 (1995).</li>
<li>Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+basis+of+proline+recognition+by+SH3+and+WW+domains%3A+Design+of+n-substituted+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors.</a> Science. 282, 2088-2092 (1998).</li>
<li>Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yielding+Behavior+in+Injectable+Hydrogels+from+Telechelic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins.</a> Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen bestaan.

In dit werk hebben we aangetoond de synthese van een zeer stabiele inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel. Gebruik van een split intein kan de hydrogel voorwaardelijk worden gevormd als reactie op het mengen van twee vloeibare-fasecomponenten. Met name de splitsing intein covalent twee vloeibare fasen bouwstenen via een trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid geflankeerd door verknoping eenheden die weer zelf assembleert een hydrogel. Het mengen geïnduceerde vorming van de hydrogel omzeilt techni...

Hydrogelen geheel gemaakt van eiwitten dragen het potentieel om uiteenlopende gebieden als tissue engineering, drug delivery en biofabrication 1 aanzienlijke vooruitgang. Zij bieden voordelen ten opzichte van traditionele synthetische polymeren hydrogels zoals biocompatibiliteit en potentieel invasief ondersteunen de opname van bioactieve globulaire eiwitten. In dit werk beschrijven we de ontwikkeling van een nieuw eiwit hydrogel gevormd via een split-inteïne-eiwit gemedieerde trans-splicing reactie en de toepassing ervan als een eiwit immobilisatie steiger (figuur 1). De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren die elk de N-of C-terminale fragment van een split inteïne (IN en IC) en een subeenheid van een multimeer proteïne crosslinker. De inteïne DnaE van Nostoc punctiforme (NPU) werd gebruikt als de splitsing intein 2,3 en een kleine trimere eiwit (12 kDa) Cuta van Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; werd als crosslinker eiwit 4,5. Verschillende verknopingsmiddelen zijn verbonden door intein gekatalyseerde trans-splicing reactie leidt tot de vorming van een sterk verknoopte proteïnenetwerk (hydrogel). NPU intein werd gekozen vanwege de snelle reactiekinetiek (t1 / 2 = 63 sec) en hoge trans-splicing opbrengst (bijna 80%) 2,3. De Cuta eiwit werd gekozen als crosslinker vanwege zijn hoge stabiliteit. Cuta trimeren een denaturatie temperatuur dichtbij 150 ° C en bewaar trimere quaternaire structuur in oplossingen die zoveel 5 M guanidine hydrochloride 4,6. Aangezien subeenheid uitwisseling tussen verschillende verknopingsmiddelen is een belangrijke bijdrage van de oppervlakte fysieke hydrogel erosie 7, dient de sterke inter-subeenheid interactie Cuta dergelijke subeenheid uitwisseling ontmoedigen, waardoor een stabielere hydrogel. Een van deze bouwstenen bevat ook een sterk hydrofiel peptide S-fragment als het midden-blok naar water gemakkelijkretentie 8. Menging van de twee hydrogel bouwstenen initieert een trans-splicing reactie tussen de IN en IC intein fragmenten, waardoor een langere polypeptideketen met verknopingsmiddelen aan beide terminals. Crosslinkers van meerdere dergelijke moleculaire eenheden met elkaar, waarbij een zeer verknoopte hydrogel netwerk (figuur 1A). Een specifiek &quot;docking station peptide&quot; (DSP) is opgenomen in een van de hydrogel bouwstenen stabiele immobilisatie van een &quot;docking eiwit&quot; (DP)-gemerkt doeleiwit in de hydrogel vergemakkelijken. Het gebruik van een split inteïne de hydrogel samenstel bemiddelen niet alleen extra flexibiliteit hydrogel proteïne synthese, maar ook zorgt voor een hoge dichtheid, gelijkmatige belasting van het doeleiwit de gehele hydrogel, als doeleiwitten worden geladen voordat hydrogelvorming. De intein gemedieerde proteïne hydrogel zeer staBLE in waterige oplossing met weinig tot geen detecteerbare erosie na 3 maanden bij kamertemperatuur. Stabiliteit wordt vastgehouden in een breed scala van pH (6-10) en temperatuur (4-50 ° C), en de hydrogel is ook compatibel met organische oplosmiddelen. Deze hydrogel wordt gebruikt voor de immobilisatie van twee globulaire eiwitten: green fluorescent protein (GFP) en mierikswortelperoxidase (HRP). Hydrogel invangen deze proteïne om biokatalyse uitgevoerd in een organisch oplosmiddel.

<table><tbody><tr><td> Phusion High Fidelity DNA polymerase </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Competent Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </td></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td>VWR</td><td>90003-350</td><td> </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><td>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> Imidazole </td><td>VWR</td><td>EM-5720</td><td> </td></tr><tr><td> Urea </td><td>VWR</td><td>EM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td> </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor cocktail </td><td>Roche Applied Science</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><td>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td>Acros Organics</td><td>A0297990</td><td> </td></tr><tr><td> Sodium Azide </td><td>Fisher</td><td>AC190380050</td><td> Voorzichtig, zeer giftig </td></tr><tr><td> Horseradish peroxidase </td><td>Sigma</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-dimethyl-p-phenylene diamine</td><td>Fisher</td><td>AC408460250</td><td> Voorzichtig, zeer giftig </td></tr><tr><td> phenol </td><td>Fisher</td><td>AC149340500</td><td> Voorzichtig, zeer giftig </td></tr><tr><td>tert-butyl hydroperoxide</td><td>Fisher</td><td>AC180340050</td><td> Voorzichtig, zeer giftig </td></tr><tr><td> n-heptane </td><td>Acros Organics</td><td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td> Shaker/Incubator </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> Ultrafiltration Tubes </td><td>Amicon Ultra</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td> &nbsp;Ni Sepharose High Performance HisTrap column </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Plate reader </td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

synthese van een inteïne gemedieerde kunstmatige protein hydrogel

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We presenteren de synthese van zeer stabiele eiwit hydrogel gemedieerd door een split-inteïne gekatalyseerde eiwit trans-splicing reactie. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Een sterk hydrofiel willekeurige spoel wordt ingebracht in een van de blok-copolymeren voor waterretentie. Menging van de twee eiwitten blokcopolymeren activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid met verknopingsmiddelen aan beide uiteinden die snel zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer stabiel onder zowel zure als basische omstandigheden, bij temperaturen tot 50 ° C en in organische oplosmiddelen. De hydrogel snel hervormingen na-afschuiving veroorzaakte breuk. Oprichting van een &quot;docking station peptide&quot; in de hydrogel bouwsteen maakt handig integreren van &quot;docking eiwit&quot;-gelabeld doelwit eiwitten.De hydrogel is compatibel met weefselgroei kweekmedia, ondersteunt de diffusie van 20 kDa moleculen en maakt de immobilisatie van biologisch actieve globulaire eiwitten. De toepassing van het inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel als een organisch-oplosmiddel-compatibele biokatalysator werd gedemonstreerd door inkapseling van het mierikswortel peroxidase enzym en bevestigende zijn activiteit.

Een schema voor inteïne-gemedieerde eiwit hydrogelvorming is weergegeven in figuur 1A. De bouwstenen van de hydrogel zijn de eiwit-copolymeren Cuta NpuN (N) en NpuC-S-Cuta (C) (Figuur 1A, tabel 1). NpuN / C zijn de N-/C-fragments van de natuurlijk splitsen DnaE inteïne uit Nostoc punctiforme (NPU). Cuta is een stabiele trimeric eiwit uit Pyrococcus horikoshii 4,5. Menging van gezuiverde N en C in aanwezigheid van het reductiemiddel DTT induceert de vorming van een de...

We presenteren de synthese van een split-inteïne gemedieerde proteïne hydrogel. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten copolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Menging van de twee copolymeren eiwit activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid die zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer pH-en temperatuur-stabiele compatibel met organische oplosmiddelen en gemakkelijk bevat functionele globulaire eiwitten.

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren van een zeer stabiele proteïnehydrogel die kan worden gebruikt als algemeen steigerwerk voor proteïne-immobilisatie. Dit wordt bereikt door eerst twee bouwstenen voor de proteïnehydrogel te synthetiseren in een bacteriële gastheer. Elke bouwsteen bevat een subeenheid van een chimeer proteïne dat dient als crosslinker en één helft van de NPU split ene.Deze eiwitten worden vervolgens in de tweede stap gezuiverd via affiniteitschromatografie. De gezuiverde eiwitbouwstenen worden gemengd om trans-splicingreacties te initiëren die een zelfassemblerend polypeptide reconstitueren, geflankeerd door crosslinkers die de vorming van een hydrogel triggeren. Deze hydrogel is zeer stabiel in oplossing door de incorporatie van een geschikt bindingsmotief in het eiwitblok.Copolymeren maken de gemakkelijke site-specifieke incorporatie van functionele gular-eiwitten in de bouwstenen van de hydrogel mogelijk, wat resulteert in de vorming van een hydrogel die eiwitten immobiliseert; geïmmobiliseerde gular-eiwitten vertonen een lage uitloogsnelheid gedurende drie weken bij kamertemperatuur. Ten slotte zijn enzymen die in deze eiwithydrogel zijn

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

We beschrijven een reeks protocollen die samen een weefsel nabootsen hydrogel bioink waarmee functionele en levensvatbare 3-D weefsel constructen kunnen worden bioprinted voor gebruik in in vitro screening toepassingen.

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

We presenteren een protocol voor de synthese van RGD-gefunctionaliseerde hydrogels als apparaten voor cel- en geneesmiddelafgifte. De procedure omvat koper gekatalyseerde alkyn-azide cycloadditie (CuAAC) tussen alkyn-gemodificeerde polyacrylzuur (PAA) en een RGD-azide-derivaat. De hydrogels worden gevormd met behulp van microgolf-geassisteerde polycondensatie en hun fysisch-chemische eigenschappen worden onderzocht.

De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Nanogels zijn een uitstekend en veelzijdig nanodeeltjesplatform voor de levering van biologische geneesmiddelen. Stimuli-responsieve poly(ethyleen) glycol-gebaseerde polymere nano-gels, die in staat zijn om op eiwitten gebaseerde ladingen in te kapselen, werden gesynthetiseerd met behulp van een eenstaps cross-linking co-nanopolymerisatiestrategie in waterige omstandigheden. De optimale fabricage en karakterisering van deze nieuwe nanodeeltjes worden hier gepresenteerd.

Synthese van stimuli-responsieve nanogels met behulp van waterige eenstaps crosslinking en co-nanopolymerisatie

Het hier gepresenteerde protocol toont de synthese van een sterke klevende hydrogelgelatine o-nitrosobenzaldehyde (gelatine-NB). Gelatine-NB heeft een snel en efficiënt weefselhechtingsvermogen, dat een sterke fysieke barrière kan vormen om wondoppervlakken te beschermen, dus het zal naar verwachting worden toegepast op het gebied van biotechnologie voor letselherstel.

Synthese van sterke kleefhydrogel, gelatine O-nitrosobenzaldehyde

Hier presenteren we twee protocollen voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogelmatrices op macroschaal zonder dat er een externe vloeibare fase nodig is.

Methoden voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogels op macroschaal

Dit protocol presenteert drie snelle en eenvoudige bereidingsmethoden die omgevingsomstandigheden gebruiken om de zelfassemblage van peptiden tot hydrogels op gang te brengen. Daarnaast wordt de karakterisering van peptidehydrogels beschreven, wat aantoont dat mechanisch stabiele peptidehydrogels onder deze eenvoudige omstandigheden kunnen worden gevormd.

Bereiding van mechanisch stabiele, zelf geassembleerde peptiden, hydrogels

Leer de synthese van een stabiele eiwithydrogel via split-intein-gemedieerde trans-splicing. Deze methode maakt eiwitimmobilisatie mogelijk in een poreus, gehydrateerd milieu zonder chemische modificaties.

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

Meer video's verkennen