アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

この手順の全体的な目標は、化学ライブラリースクリーニングを含むハイスループットスクリーニングアプリケーション用の1日細胞ベースのサイクリックA MP増感アッセイを開発することです。これは、最初に調製したアッセイ可能な凍結保存細胞を解凍し、プレーティングすることによって達成されます。第2のステップは、試験化合物またはアンタゴニストを細胞に加え、続いてアデニルシクラーゼ感作薬を添加することです。

次に、アデニリルシクラーゼ活性化剤をホスホジエステラーゼ阻害剤の存在下で添加し、環状A MPの蓄積を刺激する。最後のステップは、均質な時間分解蛍光またはHTRF環状A MP検出、溶解バッファー中の試薬で反応をクエンチし、蛍光を測定することです。最終的には、凍結保存された細胞とHTRFサイクリックA MP技術を使用することで、低分子スクリーニングのための1日の感作アッセイの実行が可能になります。

このアプローチのアイデアを最初に思いついたのは、ハイスループットスクリーニングを使用して歯科用シクラーゼの受容体媒介性異種感作を研究することに興味を持ったときでした。ここで使用される2つの主要な手法は、凍結保存された細胞を既製の試薬として使用することと、均一な時間結果を得ることです。サイクルKMPを測定するためのエッセンスアッセイキットの場合、ここで使用される基本的な方法論は、細胞ベースのアッセイを使用して細胞シグナル伝達と創薬の主要な質問に答えるのに役立ちます テキストプロトコルに記載されているように、15センチメートルの細胞培養皿で培養CHO D 2つのL細胞を開始するには、細胞を摂氏37度でインキュベートし、加湿インキュベーターで5%CO2で細胞が90〜95%コンフルエントになるまで、細胞を洗浄します。10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSが細胞を収穫し、3ミリリットルの細胞解離緩衝液を摂氏37度で5分間インキュベートした後、細胞を採取します。

Resusが12ミリリットルの培地を使用して細胞を懸濁した後、トライアンブルー排除を使用して細胞をカウントし、細胞懸濁液を室温で500Gsで5分間遠心分離します。次に、正気を吸引して蘇生し、細胞懸濁液を希釈して目的の細胞濃度を達成した後、細胞ペレットを5ミリリットルの凍結培地に懸濁し、各クライオバイアルに1ミリリットルの細胞溶液を分注します。クライオバイアルを細胞凍結容器に入れ、摂氏マイナス80度で一晩インキュベートします。

翌日、クライオバイアルを液体窒素タンクに移して長期保存し、アッセイの準備ができている細胞をプレートに最初に凍結したクライオバイアルと摂氏37度の水浴で急速に解凍します。細胞が解凍されたら、細胞を500Gで5分間遠心分離した後、チューブを3〜5回反転させてチューブを3〜5回反転させて混合し、9ミリリットルの最適液が入った15ミリリットルの円錐管に細胞を移します。室温で、スーパーナトを吸引し、細胞を最適1ミリリットルに再懸濁します。

トライアンブルー排除を使用して細胞をカウントし、細胞の生存率を判断してから、必要に応じて生細胞を希釈します。そして、ウェルあたり10マイクロリットルの細胞を最適プレートし、組織培養処理した384ウェルプレート。マルチチャンネルピペットを使用する。

サイクリックA MPの連続希釈を行い、細胞によるサイクリックA MP産生を推定するための標準曲線を生成するのに最適です。サイクリックA MPスタンダードのウェルあたり10マイクロリットルをプレートに加えます。プレートを室温で100GSで15秒間遠心分離し、摂氏37度でインキュベートし、加湿インキュベーターを5%CO2で1時間インキュベー

低分子スクリーニングでは、まず目的の薬物を所望の最終濃度の6倍まで最適に希釈します。段階希釈は、ハンドヘルドピペットまたはリキッドハンドリングステーションを使用して完了できます。試験、化合物、または緩衝液を含む車両のウェルあたり2.5マイクロリットルを追加します。

マルチチャンネルピペットを使用して、プレートを100GSで15秒間遠心分離し、溶液をウェルの側面に塗布します。持続性アゴニスト治療のための室温で、クインパロールの600ナノモル溶液を準備し、その後、ウェルの側面に600ナノモルのクインパロール溶液のウェルあたり2.5マイクロリットルで最適に調製します。マルチチャンネルピペットを使用して、プレートを再度遠心分離してから摂氏37度でインキュベートし、加湿インキュベーターで5%CO2を2時間インキュ

2時間のインキュベーション中に、テキストプロトコルに記載されているように、刺激溶液を最適に調製します。室温で1時間インキュベートする前と同様にプレートを遠心分離した後、マルチチャンネルピペットを使用して、刺激溶液のウェルあたり5マイクロリットルをウェルの側面に加えます。細胞による環状A.M.P.の産生は、メーカーの指示に従ってサイクリックA.MPダイナミック2キットを用いて簡単に測定され、蒸留水中で抗環状A.PKクリプトとサイクリックA.PDを2個分解し、1つのアリコートの抗環状A MPKクリプトと1つのアリコートのサイクリックA.MPDを別々に溶解緩衝液に希釈し、 384ウェルプレートにサイクリックAのMP蓄積をクエンチする作業溶液を作るための製造元の指示に従って、抗環状A MPクリプトのウェルあたり10マイクロリットル、8つの作業溶液、およびサイクリックA MPDのウェルあたり10マイクロリットルを追加します2つの作業溶液。

マルチチャンネルピペットを使用して、プレートを室温で15秒間100GSで再度遠心分離し、室温で1時間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーで337ナノメートルの励起を使用してプレートを読み取り、製造元の指示に従って620ナノメートルと665ナノメートルで排出量を測定します。レシオメトリック分析を適用して、メーカーの指示に従ってサイクリックA MP標準曲線を評価します。結果の値を使用して、データ解析ソフトウェアを使用して、テストウェル内の推定されたサイクリックA MP蓄積を推定します。

凍結保存されたCHO D 2 L細胞を384ウェルアッセイプレートに直接播種し、384ウェルフォーマットで感作アッセイを実施でき、ステップ数を20以上から5つに減らすことができることを実証しました。この研究では、クインペロールによる2時間前治療により、その後の4つの刺激された周期的A MP蓄積が、異種感作と一致する用量依存的に増加したことが明らかになりました。.2番目の一連の実験では、この新しい合理化されたアッセイを感作阻害剤の評価に利用できるかどうかを検討しました。

最初の結果から、ハロペリドール・オルピ・ペロンのプロトタイプDによる前処理により、2つのアンタゴニストが刺激された4つの環状A.MP蓄積に対するクイン・パロールの感作を完全に防いだことが明らかになった。次に、この方法を使用して、一連のD 2アンタゴニストの効力を評価し、これらの化合物が以前の結果と同様に感作を阻害するかどうかをテストしました。これらの研究は、Dの2つのアンタゴニストが用量依存的にアゴニスト誘発感作を阻害することを示しました。

次の目的は、テキストプロトコルに記載されているように、スケーラブルな逆トランスフェクションSI RNAライブラリスクリーニングを実施するために使用できる384ウェル感作アッセイを開発することでした。その結果、アゴニストであるQuin仮釈放に細胞を2時間曝露すると、4つの頭蓋骨が著しく増強され、サイクリックA MPの蓄積が促進されることが明らかになりました。4つのスカリンの100ナノモルと300ナノモルの両方での環状A MPの蓄積の増加は、ビヒクル処理細胞と比較して15倍以上でした。GSS irnaのDへの逆トランスフェクションは、アデニルシクラーゼのアゴニスト誘導性感作をブロックします。

D 2受容体アゴニストQuin Perolを添加し、サイクリックすると、MPの蓄積が刺激され、H-T-R-F-Aを使用して測定されました 15倍の感作反応は94%減少しました 一度習得すると、この手順に従って適切に実行されれば、このアッセイ全体を8時間以内に行うことができます。IP oneやPhospho Earthなどの他のシグナル伝達分子も測定して、追加の受容体シグナル伝達経路を調べることができます。