인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

다음 실험의 전반적인 목표는 배양된 세포의 수명 동안 세포 간 접촉이 유지되도록 신경구를 효율적으로 통과시키는 것입니다. 이 기술은 인간 신경전구세포에 필요한 확장 조건을 만듭니다. 이는 동일한 세포의 T 1 75 플라스크를 최대 2개까지 결합하고 원뿔형 튜브로 전달하여 부유 신경구를 응축한 두 번째 단계로 구체를 페트리 접시로 옮길 수 있도록 하여 블레이드가 H NPC를 작은 클러스터로 절단할 수 있도록 합니다.

다음으로, 통로 또는 잘게 잘린 신경구를 다시 부유시켜 페트리 접시에서 세포를 제거하고 새로운 플라스크로 quation합니다. 절단 기술이 확장 곡선을 기반으로 장기 성장 전략을 제공한다는 것을 보여주는 결과가 얻어졌으며, 표준 효소 접근법을 통해 계대된 세포와 비교하여 장기 대수 성장률을 보여줍니다. 이 기술의 시각적 시연은 구로서 매우 중요합니다.

응결 단계는 서면으로 설명하기 어렵습니다. 이 과정에 도움이 되는 몇 가지 트릭도 있습니다. 과도한 매체가 페트리 접시에서 완전히 제거되지 않으면 구체는 더 작은 클러스터로 분할되는 대신 매체에서 단순히 밀려납니다.

H NPC의 플라스크의 매체 색상을 처리하여 이 절차를 시작합니다. 현미경으로 플라스크를 스캔하여 세포를 관찰합니다. 가능하면 급진파를 사용하여 여러 구의 크기를 검사합니다.

직경이 300마이크로미터 이상인 구가 많은 경우 절단 과정을 진행하고 7-10일마다 세포를 절단합니다. 그런 다음 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣고 초퍼를 설정합니다. 초퍼의 전원 스위치를 켭니다.

BSC에서 절단 두께를 200마이크로미터로 설정하고 칼날 힘을 180도 또는 9시 방향 위치로 설정합니다. 그런 다음 자동 속도 노브가 가능한 한 시계 반대 방향으로 회전했는지 확인합니다. 그런 다음 테이블 분리 손잡이를 가능한 한 오른쪽으로 이동하고 플레이트 홀더가 안정적인지 확인합니다.

수동 암 매니퓰레이터를 시계 방향으로 돌려 암을 최대 높이로 올립니다. 그 후, 멸균 양날 도마를 초퍼 암 볼트에 무균 상태로 옮깁니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 집게를 사용하여 걸쇠를 칼날 위에 놓습니다.

걸쇠의 구부러진 부분은 암의 상단 가장자리 위에 있어야 합니다. 그런 다음 걸쇠를 암에 잡고 너트를 볼트에 고정합니다. 멸균 너트 드라이버가 너트를 1/4 바퀴 느슨하게 남겨 둡니다.

이 절차에서는 제안된 양의 유지 관리 매체를 새 플라스크로 옮깁니다. 그 후, 세포를 incubator에서 BSC로 무균 처리합니다. 플라스크를 튜브 랙에 기대어 구체가 플라스크에 가라앉도록 합니다.

하나는 해결되었다. 상등액 12 밀리리터까지 열망. 10mL의 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크 표면에서 느슨하게 부착된 모든 구체를 헹굽니다.

필요에 따라 반복하고 구체가 Rens 사이에 정착하도록 합니다. 다음으로, 제안된 부피의 컨디셔닝 배지를 새 플라스크로 옮깁니다. 그런 다음 나머지 모든 컨디셔닝 미디어와 구를 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

구체가 가라앉을 때까지 기다렸다가 사용한 플라스크를 버립니다. 그런 다음 15 밀리리터 원뿔형 튜브의 세포를 60 밀리미터 페트리 접시 또는 심 디스크로 가장 낮은 부피로 천천히 옮깁니다. 나머지 컨디셔닝 배지는 절단 후 접시에서 세포를 헹구는 데 사용되므로 보관하십시오.

접시의 미디어와 구체로 덮인 표면적을 최소화하십시오. 다음으로, 슈퍼 나틴을 15ml 원뿔형 튜브로 다시 옮겨 구 풀을 응축하기 시작합니다. 에어로졸 장벽 팁 마이크로 피펫터를 사용하여 미디어 셀 풀 상단에서 가능한 한 많은 매체를 제거합니다.

구가 없는 매체를 제거할 수 없을 때까지 풀을 펼칩니다. 피펫 팁의 측면을 사용하여 표면적을 늘리고 페트리 접시를 약간 기울이고 피펫 팁의 측면을 사용하여 모든 구를 수영장의 한쪽으로 부드럽게 밉니다. 모든 세포를 재배치한 후 페트리 접시를 반대 방향으로 천천히 기울여 매체가 구체에서 분리될 수 있도록 합니다.

그런 다음 투명화된 매체를 15ml 원추형 튜브로 다시 옮깁니다. 피펫 팁의 측면을 사용하여 모든 구를 페트리 접시의 중앙으로 부드럽게 다시 밉니다. 따라서 수영장의 직경은 0.5-2.4cm입니다.

스피어 풀의 깊이를 얕게 유지하는 것이 중요합니다. 웅덩이가 너무 깊으면 자르는 동안 구체가 옆으로 밀려납니다. 이제 페트리 접시를 접시 홀더에 옮기고 접시 홀더 고리 아래에 고정합니다.

테이블 분리 손잡이를 사용하여 플레이트 홀더를 왼쪽으로 밀어 블레이드가 구체에서 벗어나 기어에 고정되도록 합니다. 그런 다음 블레이드가 페트리 접시에 평평하게 내려갈 때까지 수동 조작기 손잡이를 시계 방향으로 돌려 다지기 암을 내립니다. 너트를 조이면서 암 마운트를 아래로 누릅니다.

그런 다음 재설정 버튼을 누릅니다. 한 손으로 페트리 접시를 고정시키면서 자동 암 매니퓰레이터 손잡이를 시계 방향으로 90도 또는 12시 위치로 돌리고 모든 구가 잘렸을 때 자르기 시작합니다. 플레이트 홀더를 90도 회전합니다.

그런 다음 볼트를 풀고 암을 내린 다음 너트를 다시 조입니다. 절단 절차를 반복합니다. 그 후, 무균 상태로 플레이트 홀더에서 BSC의 작업 공간으로 페트리 접시를 옮깁니다.

1ml의 컨디셔닝 배지를 잘게 잘린 구체로 옮깁니다. 그런 다음 잘린 구체를 부드럽게 다시 매달아 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 거품이 형성되지 않도록 하고 잘린 구체를 모으는 데 필요한 만큼 반복합니다.

컨디셔닝된 매체와 잘게 잘린 구체의 부피를 측정합니다. 표 2 열 E.에서 제안된 부피를 달성하기 위해 적절한 양의 유지 관리 매체를 추가합니다. 그 후, Eloqua는 각 새 플라스크에 구 현탁액을 한 번에 하나의 플라스크로 옮기고 전송 사이에 구를 다시 현탁시킵니다. 각 플라스크의 최종 부피는 표 2 열 F에서 제안한 부피와 같아야 합니다. 다진 h NPC를 인큐베이터에 넣습니다.

이 그림은 19번 통로에서 동결된 후 효소 해리를 사용하여 접착 단층으로 해동 및 팽창된 H NPC의 투영된 세포 수를 절단법을 통해 통과된 신경구와 비교하여 보여줍니다. 다음은 10배 배율로 다진 전과 후의 구를 대표하는 이미지입니다. 이 이미지는 하루 동안 도금되고 둥지와 발현을 위해 염색된 해동 통로 29 H NPC를 보여주는 반면, 이 이미지는 성장 인자가 없는 상태에서 7일 동안 도금되고 GFAP 및 베타 3 튜불린에 대해 염색된 해동 통로 29 H NPC를 보여줍니다.

이 동영상을 시청한 후에는 세포 및 배양물의 수명 동안 세포 간 접촉을 유지하는 HBC를 계대시하기 위해 자동 다지기 기술을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 만능 세포 또는 심장 구체에서 유래한 신경 줄기 세포와 같은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다.