В естественных условиях допроса центральной нервной системы Translatome по Polyribosome фракционирования

Общей целью данного эксперимента является идентификация трансляционных мРНК в первичной ткани ЦНС. Протокол начинается с извлечения соответствующих тканей из мыши в циклогексимид. Далее следует механическая гомогенизация и лизис в моющем средстве.

Затем проводится флотация миелина, которая удаляет жировые липидные компоненты тканей, которые будут маскировать профили полирибосом. Гранула, содержащая рибосомы и связанные с ними мРНК, оседает на градиенте сахарозы для разделения мРНК, связанных с рибосомами. Затем градиент фракционируется для получения полирибосомного профиля, где каждый пик представляет мРНК, связанные с определенным числом рибосом или рибосомных субъединиц.

Фракции, содержащие полирибосомы, затем очищают с получением РНК для последующего применения. Основным преимуществом этой методики из существующих методов является то, что она позволяет работать с малым количеством ткани ЦНС и универсальность в ее последующем применении. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении трансляции в нервной системе, такие как изменение уровня трансляции в различных условиях, а также роль трансляции, регуляторных факторов и мотивов последовательности.

Вообще говоря, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что in vivo материалы ЦНС обычно ограничены, а атические компоненты, присутствующие в ткани, могут маскировать профили полирибосом. Дорсально вскройте череп и удалите мозг. Перенесите мозг в ледяной буфер А и нарежьте ткань мозга кубиками.

Далее проводят ламинэктомию грудного и поясничного отделов позвоночника. Удалите четыре сантиметра спинного мозга и переложите в ледяной буфер А на лед. Нарежьте отдельные ткани кубиками, чтобы увеличить их поглощение циклохейде, а затем инкубируйте на льду в течение 15 минут.

Затем разрушьте ткани с помощью гомогенизатора пуха, чтобы ядра остались неповрежденными. Мозговую ткань требуется пятью ударами тугим пестиком, перенести сетчатую ткань в трубочки. Ткань спинного мозга требует пяти ударов рассыпным пестиком, а затем еще пяти ударов тугим пестиком.

Теперь соберите аликвоты для полного выделения РНК, 200 микролитров спинного мозга и 400 микролитров мозговой вспышки. Заморозьте их и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы удалить из ядер неповрежденные фрагменты клеток и тканей, центрифугируйте ткани при давлении 500 G в течение 10 минут.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую эндоплазматический ретикулум со связанными с ним рибосомами, и выбросьте гранулу, содержащую ядра. Затем излизируйте фрагменты мембраны эндоплазматического ретикулума для высвобождения рибосом, добавляя NP 40 и детергенты с дезоксиопокрытием натрия до конечной концентрации 1%. Дайте образцам инкубироваться в течение 30 минут на льду. Одной из сложностей работы с тканями нервной системы является то, что миелин и другие богатые липидами компоненты присутствуют в профилях Master Polysome.

Чтобы решить эту проблему, необходимо внедрить процесс моделирования флотации, чтобы удалить эти компоненты перед запуском. Ведра и ротор ультрацентрифуги предварительно охлаждаются при температуре четыре градуса Цельсия. Теперь смешайте собранные лизаты с 1,22 объемами сахарозы двух моляров.

Переложите каждую смесь в полиэтиленовую ультрацентрифужную пробирку и заполните пробирки до 10 миллилитров 1,1 молярной сахарозой. Затем аккуратно обложите трубки 0,9 молярной сахарозой. Теперь переложите пробирки в охлажденные ведра и уравновесьте их буфером B. Загрузите сбалансированные ведра в охлажденный ротор и запустите центрифугу при давлении 100 000 G. В течение трех часов при четырех градусах Цельсия рибосомы и РНК будут гранулироваться под взвешенными липидами.

После флотационного вращения миелина удалите наднатин и растворите гранулы с рибосомами в буфере В. Затем измерьте поглощение растворов рибосом на 260 нанометрах с помощью аппарата NanoDrop. Оцените общие концентрации РНК с помощью этих значений. Теперь переложите образцы на подготовленную сахарозу. Градиенты.

Будьте осторожны, чтобы не нарушить градиенты и включить пустой градиент в качестве элемента управления. Сбалансируйте охлажденные ведра с образцами, как и раньше. Затем запустите центрифугу при давлении 285 000 G в течение полутора часов при четырех градусах Цельсия.

Пока центрифуга вращается, подготовьте ректификатор. Во-первых, установите чувствительность УФ-лампы. Далее прикрепите прокалыватель пробирки к ректификатору и соедините его через трубку с бутылкой с 60% сахарозой.

С помощью промежуточного роликового насоса начните закачивать сахарозу в ректификатор со скоростью один миллилитр в минуту. Проверьте наличие утечек воздуха, которые приводят к образованию пузырьков, и затяните эти уплотнения. Затем вручную закачайте градиентный буфер в УФ-детектор, чтобы задать базовую линию.

После тщательной выгрузки образцов из ультрацентрифуги без каких-либо ударов загрузите одну пробирку в ректификатор, затем проткните дно пробирки прокалывателем. Начните закачивать 60%-ную сахарозу, чтобы сместить градиент мимо УФ-детектора в дозатор капель. Запишите профиль поглощения на 260 нанометрах.

Соберите 20 фракций из капельного дозатора в две миллилитровые пробирки. Соберите 600 микролитров на фракцию и приступайте к обработке градиентов образца до каждой фракции при 10% SDS до конечной концентрации 1% SDS и хорошо перемешайте. Теперь выделите РНК с помощью экстракции кислотным фенилхлороформом.

Начните с добавления в один объем фенилхлороформа комнатной температуры, а затем нагрейте трубки до 65 градусов в течение 10 минут. Осторожно откройте флаконы в вытяжном шкафу после нагревания, чтобы сбросить давление. Затем центрифугируйте фракции при 17 000 GS в течение 20 минут при комнатной температуре и соберите водную фазу, которая может находиться выше или ниже сахарозы.

Далее добавьте один объем изопропанола, одну девятую часть ацетата натрия и один микролитр гликосины. Осадите РНК не менее чем на час при температуре минус 80 градусов, а затем гранулируйте ее методом центрифугирования. Затем промойте гранулы охлажденным 80% этанолом и после гранулирования РНК снова высушите гранулы на воздухе, повторно суспендируйте их в воде и приступайте к анализу на последующих этапах.

В качестве альтернативы образцы можно хранить при температуре минус 80 градусов до использования. Градиент пустой сахарозы показывает некоторое фоновое поглощение на 260 нанометрах из-за присутствия DTT. Этот фон может быть вычтен во время анализа данных с целью нормализации значений образца, профили головного и спинного мозга, РНК показывают характерные кривые поглощения, мРНК, связанные с небольшими рибосомальными субъединицами, оседают в более легких фракциях, поступающих на ранних этапах профиля.

За ними следуют крупные рибосомные субъединицы и моносвязанные мРНК, мРНК, связанные с множественными рибосомами, оседают на более поздних фракциях. Обработка образцов с помощью ЭДТА привела к коллапсу пиков полирибосом, что свидетельствует о том, что профиль седиментации был обусловлен трансляцией. Дополнительные методы, такие как атака Рибота и ловушка, могут быть объединены с этой техникой для проведения исследований трансляции конкретных типов клеток.

После этого развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению роли регуляции трансляции в развитии нейронов и заболеваниях. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять фракционирование полисом из небольшого количества ткани ЦНС и очищать РНК для последующих применений по вашему выбору.