Name: 釉原蛋白 - 壳聚糖水凝胶的发展体外搪瓷愈合了密集接口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解釉原蛋白-壳聚糖水凝胶用于牙釉质体外修复的方法。该方案通过原位生长磷灰石晶体形成致密界面，显著提升修复层的机械强度与结合力，为牙科材料科学提供新途径。

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作者谨此感谢 Steven Nutt 教授和 Yuzheng Zhang 先生在聚焦离子束技术方面的协助，以及南加州大学电子显微镜与微分析中心（CEMMA）在电子显微镜方面的支持。本研究由美国国立卫生研究院口腔与颅面研究所（NIH-NIDCR）资助，项目编号为 DE-13414 和 DE-020099，授予 J.M.O.。

人类磨牙的拔除遵循南加州大学奥斯卓牙科学院的标准拔牙程序，并经机构审查委员会批准进行处理。
1. 酸蚀牙片的制备
<ol>
	<li>选择一颗无修复体且无龋损的人类第三磨牙。</li>
	<li>去除磨牙的根部，使用水冷低速金刚石锯将牙冠纵向切割成厚度为 2 mm 的切片。将这些切片超声清洗 2 分钟，然后用去离子水冲洗 3 次。</li>
	<li>为模拟侵蚀性病损，用 30% 磷酸对牙片进行酸蚀处理 30 秒，随后立即用去离子水冲洗。</li>
	<li>将酸蚀后的切片超声清洗 2 分钟，然后用去离子水冲洗 3 次。</li>
</ol>
2. 釉原蛋白-壳聚糖水凝胶的制备
<ol>
	<li>壳聚糖储备液的制备
	<ol>
		<li>将1% (w/v) 壳聚糖（中等分子量，75-85%脱乙酰化）溶解于1% (v/v) 乙酸溶液中，随后在80 °C下搅拌过夜。</li>
		<li>待溶液冷却至室温后，使用0.45 μm滤膜过滤壳聚糖溶液，并通过加入1 M NaOH溶液将pH值调节至5.0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙和磷酸盐储备液（0.1 M）的制备
	<ol>
		<li>称取氯化钙（CaCl2），配制0.1 M溶液，然后使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。通过加入1 M NaOH溶液将pH值调节至11。</li>
		<li>称取磷酸氢二钠（Na2HPO4），配制0.1 M溶液，然后使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重组釉原蛋白的表达与纯化17-18 
	本研究所用的重组全长猪源釉原蛋白（rP172）含有172个氨基酸，是全长天然猪源P173的类似物，但缺失N端甲硫氨酸以及Ser16位的磷酸基团18。
	<ol>
		<li>将20 g LB（Lysogeny broth）琼脂粉加入500 ml去离子水中，在121 °C（液体模式）下高压灭菌20分钟。待琼脂冷却至约55 °C后，向其中加入氨苄青霉素（100 μg/ml）。</li>
		<li>将琼脂溶液倒入培养皿中，待每块平板冷却凝固后倒置，以防止琼脂表面产生冷凝水。将平板置于塑料袋中，4 °C保存。</li>
		<li>从甘油保存液（-80 °C）中取重组菌株（E.coli–BC21）在LB琼脂平板上划线接种，37 °C过夜培养。</li>
		<li>配制50 ml NZCYM培养基，在121 °C下高压灭菌30分钟。待培养基冷却后，向50 ml培养基中加入50 µl 100 µg/ml氨苄青霉素。</li>
		<li>从LB琼脂平板上挑取单菌落接种至含氨苄青霉素的50 ml NZCYM培养基中，37 °C摇床过夜培养。</li>
		<li>配制1 L NZCYM培养基，在121 °C下高压灭菌30分钟。向1,000 ml培养基中加入1 ml 100 mg/ml氨苄青霉素。使用紫外-可见分光光度计测定空白对照的光密度（OD）值。注意：首次测定后请勿丢弃空白样。</li>
		<li>将步骤2.3.5中培养的10 ml菌液接种至步骤2.3.6中制备的1,000 ml培养基中。接种后立即测定595 nm处的光密度值，并定期测定OD值以监测菌体生长情况。注意：每次测OD前均需重新测定空白对照。</li>
		<li>当菌液在595 nm处的OD值达到约0.75~0.8时，加入700 µl异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，1 M）进行诱导。</li>
		<li>当OD值达到1.1时收获菌体。将烧瓶中的培养物倒入6个塑料瓶中。离心前平衡并称重各瓶。在4 °C下以8,554 × g离心20分钟。将菌体沉淀保存于-20 °C过夜。</li>
		<li>取出菌体沉淀并合并至50 ml离心管中。按每升发酵液体积加入3.5 ml 4 M盐酸胍。在冰上超声处理2-3次，每次30秒，间隔1分钟。</li>
		<li>用0.5%甲酸将细胞体积稀释6倍，在4 °C冷藏室中搅拌2小时。在4 °C下以8,554 × g离心30分钟，保留上清液。加入20%饱和硫酸铵溶液（使用饱和储备液），在4 °C冷藏室中搅拌过夜。</li>
		<li>在4 °C下以8,554 × g离心30分钟，保留沉淀。将沉淀重悬于0.1%三氟乙酸（TFA）中，上样至C4柱（10 × 250 mm，5 µm），使用A相为0.1% TFA、B相为含0.1% TFA的60%乙腈的线性梯度进行洗脱，流速为1.5 ml·min-1。</li>
		<li>将蛋白溶液在干冰上速冻，然后过夜冻干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>釉原蛋白-壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶的制备（图1A）
	<ol>
		<li>将200 µg rp172加入含有960 µl 1%壳聚糖溶液的离心管中，使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。</li>
		<li>向含釉原蛋白的壳聚糖溶液中依次加入25 µl 0.1 M CaCl2溶液和15 µl 0.1 M Na2HPO4溶液，涡旋混合5分钟。</li>
		<li>小心滴加1 M NaOH溶液，将CS-AMEL溶液的pH值调节至6.5。当pH达到6.5时，CS-AMEL水凝胶即形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 釉原蛋白-壳聚糖水凝胶中的牙釉质再生
<ol>
	<li>人工唾液溶液的制备
	<ol>
		<li>将一定量的氯化镁（MgCl2，0.2 mM）、氯化钙（CaCl2，1 mM）、磷酸二氢钾（KH2PO4，4 mM）、氯化钾（KCl，16 mM）和氯化铵（NH4Cl，4.5 mM）溶解于20 mM HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸）缓冲液12中。</li>
		<li>用1 M NaOH调节pH至7.0，并将人工唾液溶液在4 °C下保存。</li>
		<li>使用前，向溶液中加入氟化钠（NaF，300 ppm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CS-AMEL水凝胶的应用
	<ol>
		<li>用注射器将约20 µl CS-AMEL水凝胶涂布于酸蚀处理的牙片表面（图1B）。</li>
		<li>将覆盖水凝胶的牙片置于干燥器中，在室温下干燥2小时。</li>
		<li>将牙片转移至含有30 ml人工唾液溶液的烧杯中，用铝箔覆盖烧杯，然后在37 °C恒温箱中孵育7天。</li>
		<li>取出牙片，并在干燥器中于室温下干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 新生层与牙釉质界面的表征
通过扫描电子显微镜（SEM）和高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）观察新生成层与牙釉质之间界面的微观结构。透射电镜样品采用聚焦离子束（FIB）技术制备，具体步骤如下。
<ol>
	<li>将样品装入聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）仪器中，并根据操作说明完成所有对准步骤。注意：精细的Z轴调整至少应进行两次。</li>
	<li>在样品表面沉积一层碳层（15 × 3 µm），以保护其下方结构（图2A）。</li>
	<li>在碳层的上、下和右侧小心地进行铣削，制备出一片薄样品，然后切开该薄片的底部。注意：每次铣削前应检查离子束的对准情况（图2B）。</li>
	<li>将铂金尖端焊接在薄片上，并切开左侧以分离样品片（图3C）。注意：焊接前应检查离子束的对准情况。</li>
	<li>缓慢提起带有样品的铂金尖端，并将薄层样品安装到提取式透射电镜（TEM）载网上。</li>
	<li>将尖端与样品分离，并继续减薄样品，直至其厚度小于100 nm（图3D）。将样品从仪器中取出，进行透射电镜观察。注意：每次减薄过程前均需检查离子束对准情况。</li>
</ol>
5. 新生层结合性能与机械性能的评估
<ol>
	<li>通过超声处理评估结合强度。将修复后的牙片置于超声清洗仪（42 kHz，100 W）中处理10分钟，随后采用背散射电子扫描电镜分析修复层与天然釉质之间的界面。</li>
	<li>使用布氏压头纳米压痕仪，在每份修复釉质表面的20个测试点（n=3）测量显微硬度和弹性模量。</li>
</ol>
6. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>用TBS缓冲液清洗牙片15分钟。</li>
	<li>用含1%牛血清白蛋白（BSA）的TBS在室温下封闭15分钟。</li>
	<li>吸去液体，加入以TBS（含0.1% BSA和0.3% Triton X-100）按1:500稀释的一抗（鸡抗釉原蛋白抗体），4℃孵育过夜。</li>
	<li>用TBS清洗样本30分钟，再加入以TBS按1:100稀释的二抗（抗鸡IgG-FITC标记抗体），4℃孵育过夜。</li>
	<li>用TBS清洗样本30分钟，随后室温干燥30分钟。</li>
	<li>使用荧光显微镜观察结果。</li>
</ol>

<ol><li>Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-+mediated+enamel+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Protein- mediated enamel mineralization.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

虽然釉质的矿物质含量很高，使其成为人体中最坚硬的矿化组织，但这种生物陶瓷容易发生脱矿过程，常表现为龋齿或酸蚀。基因突变也可能导致釉质变薄或变软，从而引发一系列称为成釉不全症20的遗传性釉质发育异常疾病。含氟或酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙（CPP-ACP）的口腔护理产品已在市场上销售多年（例如，涂膜剂、牙膏和漱口水），用于促进早期釉质病损的再矿化。然而，这些市售产品均无法促进有序的羟基磷灰石晶体形成。对于深部釉质龋洞，传统治疗方法包括机械钻削以及使用银汞合金、陶瓷或复合树脂等人工材料进行填充。这种方法对于早期病损或釉质大面积酸蚀的情况并不理想，因为在治疗过程中需要去除过多的健康釉质，从而对牙齿造成更大损伤。银汞合金和复合树脂仅能实现暂时性的“修复”，且此类填充物通常无法阻止牙齿进一步龋坏。由于材料收缩以及化学成分和微观结构的差异，原始牙体表面与填充材料之间难以实现牢固粘接。
CS-AMEL水凝胶的优势
克服上述挑战的一种替...

牙釉质是人类牙齿的坚硬矿化表面，由大量针状的磷灰石晶体组成。这些晶体以有序、平行的方式排列成束状棱柱结构，从而赋予釉质独特的机械强度和生物学保护功能1-2与其他矿化组织（如骨和牙本质）不同，成熟的釉质是无细胞的，一旦发生大量矿物质流失便无法自我再生1-2，这种情况常表现为龋齿或牙釉质侵蚀。市面上含氟的护牙漆、牙膏和漱口水等产品在再矿化牙釉质方面有效，但均无法促进有序的羟基磷灰石晶体的形成。临床上，传统的牙釉质修复治疗通常采用填充术，使用银汞合金、陶瓷或复合树脂等人工材料进行修复。 3然而，这些材料通常难以与病损周围天然组织形成良好结合，因为它们的结构、成分和性能与天然釉质存在差异。因此，牙齿与外来材料界面处常会随时间推移发生继发性龋损。因此， 原位 具有致密界面的釉质再生成是材料科学与口腔医学领域的一个重要研究方向。实现这一目标的一种极具前景的方法是在牙釉质表面进行类釉质材料的仿生合成。近年来，大量研究 体外 已尝试利用含有纳米羟基磷灰石或不同有机添加剂的仿生系统来制备类釉质材料 4-12然而，开发出能够促进再矿化晶体形成并实现完美致密界面的最优仿生策略仍是一项挑战。 
在釉质矿化过程中，富含釉原蛋白的基质调控着磷灰石晶体的定向生长和伸长 1,13-14为模拟发育中釉质的有机基质，本文详细描述了一种制备釉原蛋白-壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶的方案，用于 原位 酸蚀釉质表面作为侵蚀性病损模型的釉质再矿化。“晶体最通用的生长培养基” 15水凝胶基质相较于溶液体系具有优势，因为在临床操作中更易于处理。此外，CS-AMEL具有生物相容性、可生物降解性，并具备独特的抗菌和黏附性能，在牙科应用中与其他仿生系统相比表现出优越性。 16重要的是， 原位 羟基磷灰石晶体在釉质表面的矿化形成了修复层与天然釉质之间的致密界面，有望提高修复体的耐久性，并防止修复体边缘新发龋齿的形成。

<table><tbody><tr><td>人第三磨牙&amp;nbsp;</td><td>南加州大学 Ostrow 牙科学院&amp;nbsp;</td><td>不适用</td><td>人磨牙的拔除遵循南加州大学 Ostrow 牙科学院的标准拔牙程序，并经机构审查委员会批准后进行处理。</td></tr><tr><td>重组猪源釉原蛋白</td><td>实验室表达与纯化&amp;nbsp;</td><td>不适用</td><td>rP172，全长&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>壳聚糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td>中等分子量，75-85% 脱乙酰化</td></tr><tr><td>磷酸&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA033266</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>VWR</td><td>A036289</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>VWR</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RP&amp;nbsp;</td><td>安捷伦科技公司</td><td>230255</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>VWR</td><td>BDH8001</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>VWR</td><td>AAAL06374</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>VWR</td><td>BDH1103</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0244</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9268</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAAA15000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸）</td><td>VWR</td><td>AAA14777</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA11561</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐溶液</td><td>伯乐公司</td><td>170-6435</td><td>10&amp;times; TBS</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>12659</td><td>CalBioChem，牛血清白蛋白，第五组分，低重金属含量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗釉原蛋白抗体</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>由南加州大学 Malcolm Snead 教授惠赠</td></tr><tr><td>牛抗鸡 IgY-FITC</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2700</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>安捷伦科技公司</td><td>Varian Prostar 210</td><td></td></tr><tr><td>C4 色谱柱</td><td>Phenomenex&amp;nbsp;</td><td>Jupiter 5&amp;mu; 300A</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>JEOL&amp;nbsp;</td><td>JSM-7001</td><td></td></tr><tr><td>聚焦离子束-扫描电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>JEOL&amp;nbsp;</td><td>JIB-4500</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr><tr><td>数字控制低速金刚石切割机</td><td>MTI 公司</td><td>SYJ-150</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>徕卡</td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器&amp;nbsp;</td><td>Branson&amp;nbsp;</td><td>2510</td><td>42 kHz，100 W</td></tr><tr><td>纳米压痕仪&amp;nbsp;</td><td>安捷伦科技公司</td><td>MTS XP</td><td></td></tr></tbody></table>

基于釉原蛋白-壳聚糖水凝胶的开发 体外 具有致密界面的牙釉质再生

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

仿生釉质重建作为治疗龋齿或牙釉质腐蚀的一种新方法，是材料科学与牙科领域的重要课题。釉原蛋白已被证实是调控羟基磷灰石晶体有序生长的关键蛋白。本文详细介绍了一种利用新型釉原蛋白-壳聚糖水凝胶实现牙釉质表层重建的实验方案。与传统的氟化物涂布或漱口水等治疗方法相比，该方法不仅能有效抑制龋齿的发展，还可促进显著且持久的牙釉质修复。由釉原蛋白自组装调控形成的有序类釉质微结构可显著提升酸蚀牙釉质的力学性能，同时所形成的致密釉质修复界面能够实现良好的结合效果。 原位 羟基磷灰石晶体的再生成可提高修复体的有效性和耐久性。此外，壳聚糖水凝胶使用简便，并能抑制细菌感染——这是龋齿发生的主要风险因素。因此，这种生物相容性好、可生物降解的釉原蛋白-壳聚糖水凝胶在缺损釉质的预防、修复和治疗中具有良好的应用前景。

通过扫描电子显微镜（SEM）、选区电子衍射（SAED）和X射线衍射（XRD）分析，验证了本方案的有效性。经釉原蛋白-壳聚糖（CS-AMEL）水凝胶修复7天后，在酸蚀的釉质表面形成了厚度约为15 μm的类釉质层。新生长的层由直径约50 nm的高度有序晶体阵列组成，晶体优先沿c轴方向生长，垂直于表面（图3A中的箭头所示）。值得注意的是，这些针状晶体被组织成束状结构，类似于天然釉质的基本结构单元（图3B）。修复层的SAED结果显示呈弧形衍射图案，表明新生晶体沿[002]方向呈分级排列（图3C）。XRD分析进一步证实，新生层由羟基磷灰石晶体组成，且晶体沿结晶学c轴取向排列，与SEM和SAED观察结果一致（图3D）。
图4展示了新生釉质层与天然釉质之间界面的微观结构。需要注意的是，新生晶体的生长方向与原始釉质晶体并不相同。可以看出，蛋白质介导的磷灰石生长导致新生晶体相对于天然釉质晶体呈垂直取向（图4A</st...

本文介绍了一种制备釉原蛋白-壳聚糖水凝胶用于牙釉质表层重建的实验方案。有序 原位 羟凝胶中磷灰石晶体的生长形成了致密的釉质-修复界面，这将提高修复体的有效性和耐久性。

仿生釉质重建是材料科学和牙科领域的重要课题，作为一种治疗龋齿的新方法……

本实验的总体目标是建立一种利用AMLO和壳聚糖水凝胶进行表层牙釉质重建的制备方案。该过程首先制备酸蚀处理的牙片；第二步，制备新鲜的AMLO和壳聚糖水凝胶。接下来，将AMLO和kitan水凝胶涂覆于牙片表面。最后，在人工唾液中利用AMLO chizen水凝胶再生牙釉质。最终，可通过超声处理和纳米压痕技术评估新形成层的机械强度及其与天然釉质的结合能力。该技术的应用前景在于开发一种可用于成人和儿童患牙牙釉质的治疗方法，能够阻止早期龋损的发展，重建因龋损而流失的牙釉质，保存牙齿结构，并防止蛀牙进一步进展。本次操作演示由我实验室的博士后研究员 Dr. Chittar 一进行。首先选取一颗无修复且无龋损的人类第三磨牙。使用水冷式低速金刚石锯将牙冠纵向切割成两毫米厚的切片，然后通过超声方式去除磨牙的牙根部分。用离子水清洗切片两分钟，再用离子水冲洗三次，以模拟侵蚀性病损。用30%磷酸对两片切片进行酸蚀处理30秒。然后立即用去离子水冲洗，再进行超声处理。将蚀刻后的切片再次清洗两分钟，并用去离子水冲洗。重复三次。用于制备卡桑储备液。首先将1%（重量/体积）的卡桑溶解于1%（体积/体积）的乙酸溶液中，随后在80°C下搅拌过夜。将溶液冷却至室温后，通过0.45微米滤膜过滤 esan，然后加入1摩尔氢氧化钠将pH值调节至5.0。配制钙和磷酸盐储备溶液时，称取氯化钙并配制成0.1摩尔的溶液。接着涡旋振荡溶液直至澄清，并用1摩尔氢氧化钠将pH值调节至11。然后称取二碱磷酸钠，配制0.1摩尔的溶液，并涡旋至溶液澄清。为制备AMLO基因改性水凝胶，将960微升新配制的1%esan溶液加入含有200微克重组猪源AMLO基因的离心管中。然后涡旋振荡溶液至澄清。接着，向含有奥扎尼的AMLO溶液中加入25 µL的0.1 M氯化钙溶液，随后加入15 µL的0.1 M磷酸氢二钠溶液。涡旋振荡溶液5分钟。然后小心加入1摩尔氢氧化钠，将AMLO和奥扎尼溶液的pH值调节至6.5。当pH值达到6.5时，AMLO和奥扎尼水凝胶将形成，从而在AMLO和奥扎尼水凝胶中启动牙釉质再生。首先，用1摩尔氢氧化钠将人工唾液溶液的pH值调节至7.0，并将该溶液在4摄氏度下保存。然后使用注射器将约20微升的AMLO和奇曾水凝胶涂抹于边缘牙片上，并将其置于室温下的干燥器中。两小时后，向唾液溶液中加入 300 PPM 的氟化钠，然后将牙片转移至含有 30 毫升该溶液的烧杯中。用铝箔覆盖烧杯，随后将烧杯置于 37 摄氏度的烘箱中。最后，在 3 至 7 天后取出牙片，在经 AMLO 和 chizen 水凝胶修复 7 天后，蚀刻的牙釉质表面会形成一层厚度为 15 微米的类釉质层，将牙片置于干燥器中室温下干燥至恒重。新生成的层由高度有序的晶体阵列构成，晶体直径约为50纳米，优先沿垂直于表面的c轴方向生长。注意，这些针状晶体被组织成束状结构，类似于天然釉质的基本结构单元。修复层的选区电子衍射图像呈现出弧形图案，表明新生成的晶体具有层级排列的取向特征。沿 0 0 2 方向的 X 射线衍射分析证实，新生成的层由羟基磷灰石构成，这些羟基磷灰石沿晶体学 C 轴排列，这与扫描电子显微镜及选区电子衍射观察结果一致。本图显示了新生层与天然釉质之间界面的微观结构。请注意，新生晶体并未沿原始釉质晶体的方向生长，而是在蛋白质介导的羟基磷灰石生长过程中，相对于天然釉质晶体呈垂直取向。新生层与釉质基底之间的界面处无明显间隙。在纳米尺度上，牙釉质与再生晶体融合在一起，形成了无缝的界面。经过10分钟的超声处理后，AMLO Genin 壳聚糖水凝胶中形成的新生层仍与牙釉质表面紧密连接，且经 tizen 水凝胶处理但不含 amelogen 的样品其有序结构得以保留。然而，牙釉质与修复层之间出现明显的大间隙，可清晰区分新生层与天然牙釉质。在本实验中，新生成的层中的 AMLO genin 通过免疫荧光标记进行检测，新生成层内出现的绿色荧光证实了 AMLO genin 的存在。如图所示，经过酸蚀处理后，釉质表面的硬度和模量分别下降了近 98% 和 88%。使用不含 AMLO genin 的奥占水凝胶处理的对照组，在硬度和模量方面仅表现出有限的改善。相比之下，在 AMLO 和 ozan 水凝胶中矿化后，其模量增加了近四倍，硬度增加了九倍。在体外及后续的模型评估中，该方案可进一步拓展用于设计治疗釉质缺陷（如早期龋损和侵蚀）的技术。

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Research

科研

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Bioengineering

生物工程

釉原蛋白 - 壳聚糖水凝胶的发展<em&gt;体外</em&gt;搪瓷愈合了密集接口

目前干细胞治疗面临的主要障碍之一是确定将这些细胞递送至宿主组织的最有效方法。在此，我们描述了一种基于壳聚糖的递送方法，该方法操作简便且效率高，同时能够维持脂肪来源干细胞的多向分化潜能。...

构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

一种由含海藻酸盐微粒的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素（PNIPAAm-g-CS）组成的可注射组织工程支架被制备出来。其黏附强度、溶胀性能及 体外...

用于组织工程的含海藻酸盐微粒的热致凝胶化聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素复合材料的合成

理解釉质形成及其可能的改变需要研究成釉细胞的活性。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖包含分泌期和成熟期成釉细胞的釉质器官，该方法可用于后续的定量与定性实验操作。...

环境毒物暴露大鼠下颌门齿釉器官的显微解剖

重组蛋白工程水凝胶因其可完全调控聚合物主链，从而调控细胞微环境，故在三维细胞培养中具有显著优势。本文描述了重组弹性蛋白样蛋白的纯化过程及其在三维水凝胶细胞包封中的应用。...

用于细胞三维包封与免疫染色的弹性蛋白样蛋白水凝胶的制备

本文介绍了利用壳聚糖薄膜培养人牙周膜（PDL）细胞球体的实验方案。三维（3D）细胞球体培养提供了一种替代传统组织培养聚苯乙烯（TCPS）培养系统的方法。...

在壳聚糖薄膜上形成人牙周膜细胞球体

本方案介绍了一种在微重力条件下培养成釉细胞样细胞并实现其三维生长的方法，以维持细胞的细长极化形态及牙釉质特异性蛋白的表达。同时描述了牙周组织工程构建物和肺器官在微重力条件下的培养条件。...

微重力条件下牙源性和呼吸系统细胞与器官的增殖

我们提出一种从人类牙齿开始建立上皮类器官培养的方案。这些类器官具有强大的可扩增性，并能重现牙齿上皮干细胞的特性，包括其成釉细胞分化能力。这一独特的类器官模型为研究人类牙科（干细胞）生物学提供了有前景的工具，并有望应用于牙齿再生策略。...

建立人类牙齿类器官：推动机制研究与再生治疗的有力工具

本方案描述了一种基于壳聚糖-京尼平的非乳液法微凝胶制备方法。这些微凝胶的尺寸可精确调控，并具有pH依赖性溶胀特性以及可降解性...

用于组织工程的尺寸可控且无乳液的壳聚糖-京尼平微凝胶的制备

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

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开发用于评估伤口敷料材料与负压伤口治疗系统兼容性的台式模型

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

了解釉原蛋白-壳聚糖水凝胶用于牙釉质体外修复的方法。该方案通过原位生长磷灰石晶体形成致密界面，显著提升修复层的机械强度与结合力，为牙科材料科学提供新途径。

基于釉原蛋白-壳聚糖水凝胶的开发体外具有致密界面的牙釉质再生

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