Name: プロデュース上皮損傷の解析赤痢アメーバ感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶEntamoeba histolytica感染における上皮細胞のタイトジャンクション解離メカニズム。免疫蛍光法と経上皮電気抵抗測定を用いて、寄生虫の侵襲性と宿主細胞相互作用を評価する方法です。

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この作業は、連邦地区科学技術研究所（ICyTDF, 64/2012からEOへ）およびメキシコ科学技術評議会（Conacyt））179895からMSへの助成金によって支援されました。

Eの1。確立と維持アメーバ培養 <ol><li> （他のすべての汚染の生物の完全無料）無菌的に成長する赤痢アメーバ株のHMLの1×10 5栄養型：InterScan MSSはテフロンライナースクリューキャップ（または使い捨てのT-1×10 6栄養型と18 125×16 mm培養チューブのクローンを作成するTYI-S-33培地、3％ダイヤモンドビタミン混合物を補充した（TYIブロス、10％熱不活化成体ウシ血清、0.5 IU / mlペニシリン、および35μgの25フラスコ）にし、15ml（又はT-25フラスコ中の50ml）中/ストレプトマイシン）19 37℃のインキュベーター内</li><li>ガラス培養管に取り付けられた栄養を放出する氷水浴中で5〜10分間培養管を冷却することにより、通常、48〜96時間間隔（ 図1）での対数増殖期の間に収穫栄養。 </li><li> CELを分散させるための円錐チューブに文化を転送し、それを数回転倒LS。血球計算板（ノイバウアー室）を使用して、細胞数を決定し、新鮮なTYI-S-33培地を含む培養チューブに接種物を移す。 <ol><li>長い潜伏期間（〜5日間〜3×10 5細胞）と短い期間のためのより高い番号（〜1日の〜1×10 6細胞）のためにアメーバの低い数字を使用してください。カウント接種材料が望ましいが接種物の推定体積が実現可能であるように、確立された文化が予測可能になる。 </li><li>各実験について、細胞数を最適化するために、栄養の量を滴定する。 </li><li>不注意による汚染やチューブの破損の場合にはバックアップを持っているパラレル·重複の文化を維持している。 </li></ol></li><li>キャップチューブしっかりと5°傾いた水平画角で、37℃でそれらをインキュベートする。 </li><li>文化の過度の成長が多く、溶解した細胞が含まれている可能性があるので、定期的に目視での文化を確認してください。 </li></ol> MDCK培養2。確立と維持&lt;/ pの&gt; <ol><li> （マディンダービーイヌ腎臓）細胞/ 0.08 U（インスリン、ペニシリン（100 IU / ml）を、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を補充したDMEM培地10mlの使い捨てT-75フラスコ中でI（高抵抗）型MDCKを成長させるml）と37℃で5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中の10％新生児ウシ血清</li><li>セルを分割するには、倒立顕微鏡でそれらを確認してください。彼らは〜百分の85から100までコンフルエントのときセルを分割。 </li><li>無菌フードや文化からメディアを除去する滅菌ガラスパスツールピペットで真空吸引器を使用してください。スクレーピング細胞を回避するために、下の隅から逆さまにフラスコを回して吸引メディア。 </li><li> T-25フラスコの場合にT-75フラスコ（5mL中へ予め温めたPBS（140mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH7.4）を10mlのを分与）、静かに細胞を洗浄するために、フラスコを揺する。真空吸引によって、PBSを除去します。血清はトリプシンを阻害するので徹底的な洗浄が必要です。 </li><li> （T-25フラスコに0.5mlのを使用）および穏やかにトリプシンで細胞層を覆うようにフラスコを揺するT-75フラスコ中に0.05％トリプシンを1.5mlの分注する。 </li><li> （正確な時間は、トリプシン活性に依存します）インキュベーター内で5〜10分間インキュベートします。 </li><li>逆光フラスコを保持することによって細胞の剥離をチェックし、細胞を流すためにしています。 （細胞を四捨五入）細胞剥離はまた、顕微鏡を用いて確認することができる。多くの場合、細胞はフラスコの側への迅速な、優しい平手打ちで速い放出。 </li><li> T-75フラスコ（T-25フラスコのために5ミリリットル）に添加したDMEMの15ミリリットルを追加します。ピペッティング4または5倍に細胞を再懸濁。 </li><li>細胞を増殖させる、新鮮な補充されたDMEMで細胞懸濁液を1:5に希釈する。セル番号は、血球計数器を用いて、この時点で決定することができるが、特定のアッセイのための特別な形式にセルを分割する場合、これは通常は必要である。 </li></ol>栄養型全溶解の3。準備<ol><li>立方から栄養を切り離す氷水浴中で5〜10分間チューブを冷却することによりlture管。 4℃で10分間360×gでコニカルチューブと遠心分離機に無菌的に文化を転送慎重に、デカンテーションにより上澄み液を捨て、ペレットを氷冷PBSを追加し、10分間360×gで再び細胞や遠心分離機を分散させるために、チューブを数回転倒。 TYI-S-33培地を完全に除去するために二回、この手順を繰り返します。 </li><li>血球計数器を使用した栄養型の数を決定します。 </li><li>溶解は、凍結融解サイクルによって栄養型。 1分間、液体窒素中で氷冷PBSで希釈した栄養体の測定された接種材料（60万栄養個/ ml）を、スナップ凍結。 4℃、激しくボルテックスでサンプルをアンフリーズします。細胞溶解を完了するために、凍結融解を3回繰り返します。 </li><li> 0.02％β-メルカプトエタノールと溶解液中に存在するプロテアーゼをアクティブにします。 </li></ol>栄養型分泌生成物の4。準備<ol><li>ステップ3.2に3.1を実行してください。 </li><li>決定する血球計数器を使用し、トリパンブルー排除試験20を適用し、この時点での細胞数及び生存率： <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブに9×10 6 3ミリリットルの氷冷PBS中栄養型と転送細胞を希釈する。この懸濁液10μlを取り、0.4％トリパンブルー原液のpH 7.2の1を添加する。 </li><li>低倍率での細胞をカウントするためにノイバウアー室を使用してください。 </li><li>すべての細胞を計数し、細胞が青色色素を取り込んだとデッド考慮しなければならないので、青色細胞の数を分離する。 </li><li>細胞の総数により生存細胞の数で割り、100を掛けることによって生存細胞の割合を計算する。 </li></ol></li><li> 5°傾いた水平画角での2時間37℃でインキュベーターに栄養型懸濁液を含むコニカルチューブに移します。 </li><li> 10分間360×gで分泌される製品、遠心管を収集します。使い捨て無菌注射器を使用し、丁寧にSUを収集pernatant、ペレットからの栄養型とサンプルの汚染を避ける。 0.22μmの酢酸セルロース膜を通して上清を渡すことで、任意の転送細胞を排除する。 β-メルカプトエタノール、0.02％とプロテアーゼをアクティブにします。 </li><li>死細胞から放出された分子と推定される不必要な汚染を破棄するには、細胞の生存率のために、トリパンブルー排除試験を再適用します。ステップ4.2で得られた細胞の生存と総数は同じである必要があります。そうでない場合には、回収した上清は、分泌タンパク質を含有することができるのみならず、破棄されるべきである。 </li></ol>栄養型、栄養型溶解物または分泌生成物とのMDCK細胞の5。相互作用<ol><li>ライブ栄養型（1:1のMDCK対アメーバ比）でコンフルエントのMDCK細胞単層をインキュベート、栄養型溶解物（MDCK·ツー·アメーバ1:2）または分泌生成物（1のMDCK対アメーバ比：2と30分（ 図2A）、37℃で10）。 </li><li>非結合分子または栄養型を排除するために、氷冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。 </li></ol>免疫蛍光のためのサンプルの6。準備<ol><li> 24ウェル細胞培養皿の内側に配置滅菌ガラスカバースリップ上で培養MDCK細胞。彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。その後、新鮮なDMEM培地1mlで培地を交換し、より多くの24時間37℃のインキュベーターにプレートを転送する。 </li><li>真空吸引器と滅菌ガラスパスツールピペットを用いて培地を除去し、各ウェルに暖かい1mlのPBSを加える。 PBSを削除し、新しいPBSでの洗浄を繰り返します。ガラスピペットで井戸の底から細胞を傷が付かないように注意してください。 </li><li>ライブ栄養型（T）、栄養型全溶解（TL）と分泌生成物（SP）：暖かい1mlのPBSで希釈した栄養体のさまざまな条件を追加します。 <ol><li> 2または30分間インキュベーター内で培養プレートを置く。 </li><li> 1という時間0分、MDCK細胞を大腸菌とインキュベートしていないする必要があります。2の制御条件を準備アメーバだけ暖かい1mlのPBSで;この場合の二次抗体コントロールなどの他の条件は、2または30分間、T、TLやSPとMDCKインキュベートし、一次抗体とのインキュベーションを省略します。 </li></ol></li><li>非結合分子または栄養型を排除するために、冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。 </li><li>修正して、-20℃で30分間、96％エタノール1mlで細胞を透過</li><li>エタノールを除去し、室温で1mlのPBSで3回洗浄し、迅速に実行します。 </li><li>サンプルの乾燥を避けるために、湿潤チャンバー内の次の手順を実行します。 <ol><li>閉じられた試料を安全に載置可能なウェットペーパータオルで充填することができる任意の利用可能な箱を使用する。たとえば、空のピペットチップボックスは、この目的を果たす。 </li><li>室内に、均等にブロックのパラフィルム層とピペット25μLを配置各カバースリップ用の溶液（0.5％BSA）をING。 </li><li>微細鉗子でウェルからカバースリップを取り、注意深く濾紙で縁から過剰な液体を除去し、細胞をブロッキング溶液に対向してブロッキング溶液（0.5％BSA）を含有する液滴にカバースリップを置く。室温で1時間試料をインキュベートする。 </li></ol></li><li> PBS中の一次抗体の混合物を準備したIgMマウス抗EhCPADH112（Mα-EhCPADH112、1:10希釈）およびIgGウサギ抗ZO-1（Pα-ZO-1、1:100希釈）。 </li><li>湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。 </li><li>ブロッキング溶液からカバースリップを持ち上げ、濾紙を用いてエッジで余分な液体を乾燥させ、そして抗体溶液に面する細胞と滴にそれらを配置する。 4℃で一晩サンプルをインキュベート</li><li> 24マルチウェル（上部のセル側）のウェルに各カバースリップを入れて、1mlのPBSを加える。 <ol><li&gt;非結合分子を除去するために1mlのPBSで5回洗浄する。 </li></ol></li><li> FITCと結合したヤギ抗IgMマウス（1:100希釈）とTRITC（1:50希釈）に結合されたヤギ抗IgGウサギ：PBS中に蛍光二次抗体の混合物を準備します。 </li><li>湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための二次抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。 </li><li> 6.10のようにサンプルを転送し、蛍光色素の退色を避けるために、暗所で室温で1時間インキュベートする。ステップ6.11.1を繰り返します。 </li><li>核染色のために、室温で0.05 mMのDAPI溶液200μlで3分間インキュベートし、光から保護します。ステップ6.11.1を繰り返します。 </li><li> 、蛍光色素を節約する5μLVECTAシールドにカバースリップ（細胞を下向き）を配置するために顕微鏡用スライドガラス上にマウントソリューションを退色防止。試料乾燥を避けるためにマニキュアを使用してカバーグラスをシール。 </li><li>長期保存のために、スライドを保つ-20℃での顕微鏡用スライドボックス</li><li> zスタックセクションとXZ-面（ 図2A）を介して共焦点顕微鏡による調剤を分析します。 </li></ol>プロテアーゼ阻害剤または特異的な抗体を用いて栄養型の7。インキュベーション<ol><li>繰り返して3.2に3.1を繰り返します。各実験条件については、4でプロテアーゼ阻害剤（コンプリート1 mMおよび40μg/ mlのE-64）、または20分間EhCPADH112（mαEhCPADH112）21に対して、30μgのモノクローナル抗体（50μlのPBS中に再懸濁）1×10 5栄養型インキュベート℃（ 図2B）。ステップ8.5で説明したように同時インキュベーションアッセイのためにこれらの製剤を使用してください。 </li></ol>経上皮電気抵抗（TER）の8。測定<ol><li>無菌トランスウェル透過性サポート（0.4μmの孔径）上で培養したMDCK細胞。上部コンパートメントには、細胞懸濁液を100μlを配置し、下部コンパートメント内DMEM培地を600μlを置く。 <ol><li>定期的に中レベルを確認してください。必要に応じて新鮮な培地を添加することができる。 </li><li>彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。 2〜3日ごとに培地交換。 </li><li>細胞接着（必要な場合）を改善するために、細胞懸濁液を添加する前にDME​​Mで37℃で一晩トランスウェルフィルターを平衡化。 </li></ol></li><li> UV光下で、15分間ずつエタノールに浸漬することによりフード内STX2電極を殺菌した後、滅菌PBS中。 EVOM上皮voltohmmeterに電極を接続し、抵抗モードを選択します。 </li><li>各トランスウェルの上部コンパートメントから培地を収集し、それらをプールする。このメディア混合液50μlを取り、栄養型懸濁液50μl（PBS中1×10 5栄養型）またはPBSのみ（対照）とそれを組み合わせる。各トランスウェルのために同じような混合物を使用してください。 </li><li>各トランスウェルcontaininの上室に混合物を添加G MDCK細胞。実験条件は、栄養型（コントロール）することなく、栄養型またはプロテアーゼ阻害剤又はmαEhCPADH112と共にプレインキュベートした栄養体との共培養をMDCK細胞が挙げられる。フィルタによって提供される抵抗を排除するために、培地のみとインキュベートしたトランスウェルを使用しています。各実験条件について少なくとも3トランスウェルを使用しています。 </li><li>すぐに、各トランスウェルにSTX2電極を浸漬することによりTERを測定します。 <ol><li>長い電極が下部チャンバーの底部に接触し、短い電極は（ 図2（b）参照 ）は、上部区画内の媒体によって覆われていることいることを確認してください。 </li><li>毎回垂直に電極を保持するようにしてください。これは、有意に、再現性を改善する。これは、データの変化につながるように移動したり、測定中に電極を傾けることは避けてください。 </li></ol></li><li>この測定は、初期のTER値を考慮する必要があります。すると、次の中にTERを監視30分。 </li><li>最終のTER値を計算するために、唯一のフィルタのTER値を減算する。異なる実験からの結果を比較すると、100％（ 図2B）、これらを考慮して、初期値に各データポイントを正規化する。 </li></ol>

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<li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li>
<li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li>
<li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

E.により、上皮感染中インビトロ宿主-病原体相互作用を研究するためにアメーバは、上皮細胞と栄養の両方の老舗の文化と連携することが重要である。例えば、以前は、E.アメーバ培養は通常、細菌やtrypanosomatids 22,23の特定の種に関連して確立されていた。 Eのが、共培養アメーバ培養宿主細胞で観察された影響がはっきりとameobasに帰することができませんでしたではなく、共培養細胞の影響である可能性があるため、宿主-病原体相互作用の研究のための逆効果である。このように、Eのaxenical文化アメーバは、特定の宿主-病原体相互作用の検査のために望ましい。提供されたプロトコルでは、以下の方法について説明Eのような無菌栽培アメーバは、特に感染症研究のためのこのような培養物を利用するために達成することができます。さらに、タイミングEの収穫アメーバにも非常に重要です。E.アメーバの収...

赤痢アメーバは、人間のアメーバ、炎症や下痢を引き起こす腸の感染症の責任ある単細胞の原生動物である。E.アメーバは毎年5000万個人にまで感染するが、感染者の約10％がアメーバ1に関連した症状を起こす。感染はEを含む汚染された食物や水の摂取時に起こるアメーバ嚢胞 。腸内で、嚢胞は、大腸ムチンに付着し、2を増殖するライブ栄養型を生産する。栄養型は通常、便を経由して排泄される嚢胞を形成している。他のケースではまだ未知の理由のために、栄養型は腸管上皮層を破壊し、下層組織に侵入する。最悪のケースでは、それらは血流に入り、肝臓3など他の臓器に影響を与える。 上皮バリアを破ることは入社細胞を維持する上皮性膜貫通構造の破壊を必要とします。上皮細胞連絡先はタイト（TJ）からなる頂端接合部複合体により形成され、接合（AJ）を接着結合、および4をデスモソームている。ほとんどの頂端接合部は、TJであるため、彼らはEで侮辱し第一関門であるホスト侵入中にアメーバといくつかの他の病原体。 TJは、隣接セルの受容体とホモまたは異種相互作用に関与クローディン、オクルディンおよび接合部接着分子（JAM）のような膜貫通接着受容体で構成されている。それらは、細胞内で上皮にさらなる機械的強度を提供するために、アクチン細胞骨格に接着レセプターを接続する閉鎖帯（ZO）ファミリーの足場分子によって結合される。 TJは、過剰な水および溶質の漏れを防止する、腸管内腔から腸組織をシールするための責任がある。 TJは、寄生虫によって破壊された後にこのように、組織を侵略している。E. （I）TARGにアメーバの接着に関与するもの： アメーバのようないくつかの分子を分泌するらセル5; （ii）は、例えば、エキソサイトーシスによって宿主細胞の殺傷に関与する膜活性因子、6,7 amoebaporesと呼ばれるイオンチャネル形成ペプチドを;および（iii）細胞外マトリックスタンパク質を分解し、組織崩壊を媒介5,8,9プロテイナーゼ。 一緒にEhCPADH112複合体を形成するシステインプロテアーゼEhCP112及び接着分子EhADH112は、2つのE.あるTJ 10の分解に大きな役割を果たしているアメーバの病原性タンパク質。ライブ栄養型、それらの総溶解物および分泌された製品は、上皮バリアのTJ複雑で機能障害の分子の変化を誘導する。本研究では、EhCP112とEhADH112は、このようにEを容易に細胞タンパク質の内在化と分解をもたらすオクルディンとクローディン1タンパク質と相互作用することが示されている傍細胞経路を介したアメーバの入り口。 我々のデータは、これらのOF他のグループ11から17を強く寄生虫の侵入を可能にする特定宿主-病原体相互作用の必要性を示唆している。これらの相互作用の分子基盤を解明することはアメーバ症の病因のより良い理解のために最も重要である。傍細胞透過性の増大によって特徴付け栄養によるTJの選択的な外乱が、経上皮電気抵抗（TER）の減少によって測定することができる。宿主上皮に向かって寄生タンパク質の移動は、免疫蛍光染色および共焦点レーザー顕微鏡法も可能での直接的な相互作用を示す上皮接合部のマーカーとアメーバの病原性因子の共局在を明らかにすることができる方法によって決定することができる。この記事では、上皮細胞と栄養が、栽培収穫し、宿主 - 病原体相互作用とその結果を検討するために操作する方法を詳細に説明します。

<table><tbody><tr><td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, クローンA&nbsp;</td><td>IMSS病院、メキシコ</td><td>無数/数</td><td>毒性の栄養型18&nbsp;</td></tr><tr><td>TYI ブロス</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー メルク メルク メルク J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich</td><td>211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879</td><td>3.45% BBL バイオセート ペプトン 58 mM グルコース 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM アスコルビン酸 8.1 mM L-システイン 0.1mMクエン酸第二鉄アンモニウムは、pH 6.819</td></tr><tr><td>ウシ血清成人</td><td>Microlab、ラボ、メックスを調整します。</td><td>SU146</td><td>10% で使用し、56 °C まで不活性化します。C for 30 min</td></tr><tr><td>ダイヤモンド&nbsp; ビタミン&nbsp; 混合物- Tween 80</td><td>In vitro</td><td>SR-07</td><td>3%</td></tr><tr><td>ペニシリンで使用&nbsp;</td><td>湖畔、&nbsp;M&eacute;x.</td><td>34564SSA IV</td><td>0.5 IU/ml</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>湖畔、&nbsp;M&eacute;x.</td><td>75757SSA IV</td><td>35 & マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>Pyrex 15 ml スクリューキャップ 培養チューブ、PTFEライニングフェノールキャップ</td>付き <td>Corning-Pyrex</td><td>9826-16X</td><td>16 x 125 mm、容量15 ml、キャップは温度の影響に強い特別な処方で製造</td></tr><tr><td>細胞培養プレート、6ウェル</td><td>Corning-Costar</td><td>3516</td><td>滅菌プレート、ウェル直径34.8 mm、成長面積9.5 cm2.&nbsp;蓋のリングはクロスコンタミネーションを防ぎます</td></tr><tr><td>25 cm2細胞培養フラスコ</td><td>Corning-Costar</td><td>430168</td><td>傾斜ネックフラスコ</td></tr><tr><td>MDCK(Madin Darby 犬の腎臓)I型</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>CCL34</td><td>60thと90th継代</td></tr><tr><td>DMEM培地の間で</td>増殖した腎臓上皮細胞&nbsp;<td>ギブコ&nbsp;</td><td>12800-017</td><td>ダルベッコの改良イーグルミディアムと高グルコース。</td></tr><tr><td>新生児用子牛血清</td><td>In vitro</td><td>S-02</td><td>10%で使用してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン混合物&nbsp;</td><td>インビトロ&nbsp;</td><td>A-01</td><td>ストックソリューション 10,000 U/&micro;g/ml</td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;&nbsp;</td><td>AMSA</td><td>398MJ94SSA IV</td><td>ストック溶液 100 IU/ml</td></tr><tr><td>トリプシン溶液&nbsp;</td><td>In vitro</td><td>EN-005</td><td>0.05% 酵素溶液 カルシウムとマグネシウムなし</td></tr><tr><td>75 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>Corning-Costar</td><td>430720</td><td>TYI-S-33 培地での栄養型培養用の傾斜ネックフラスコ</td></tr><tr><td>トランズウェル透過性サポート</td><td>Corning-Costar</td><td>3470</td><td>0.4 & micro;M ポリスターメンブレン、6.5 mm インサート、24 ウェルプレート、増殖領域 0.3 cm2</sup</td></tr><tr><td>>24-well 細胞培養皿&nbsp;&nbsp;</td><td>Corning-Costar</td><td>3524</td><td>透明ポリスチレン、最適な細胞付着のために処理、ガンマ線による滅菌、非発熱性の認定</td></tr>済み <tr><td>Complete Mini</td><td>Roche</td><td>11836 153 001</td><td>プロテアーゼ阻害剤カクテルは、広範囲のセリン、システイン、メタロプロテアーゼを阻害します。最終濃度 1 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>トランス-エポキシサクシニル-L-ロイシルアミド(4-グアニジノ)ブタン(E-64)</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>E3132</td><td>Cysteinプロテアーゼ阻害剤、最終濃度40 & micro;g / ml</td></tr><tr><td>のp&α;ZO-1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td>IgGウサギポリクローナル&nbsp;抗体&nbsp;ZO-1ヒトタンパク質m&αの中央領域にある合成ペプチドに対して</td></tr><tr><td>&nbsp;EhCPADH112</td><td>自家製抗体</td><td>IgM マウスモノクローナル抗体なし/数 IgM マウスモノクローナル抗体 &nbsp; 444-601 エピトープ EhCPADH11221,27</td><td></td></tr><tr><td>FITC-FITC-ヤギ抗マウス IgM</td><td>Zymed</td><td>62-6811</td><td>フルオレセイン イソチオシアネート (FITC) 標識ヤギ抗マウス二次抗体 &nbsp; 抗体</td></tr><tr><td>TRITC- ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)</td><td>Zymed</td><td>816114</td><td>テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)標識&nbsp;ヤギ抗ウサギIgG&nbsp;二次抗体。</td></tr><tr><td>STX2 電極</td><td>ワールド精密機器&nbsp;</td><td>102711</td><td>幅4mm、厚さ1mmの固定ペアの二重電極で構成されています。電極ペアの各スティックには、電圧を測定するための銀/塩化銀ペレットと電流を流すための銀電極が含まれています。EVOM</td></tr><tr><td>EVOM上皮電圧計</td><td>World Precision Instrument&nbsp;</td><td>12111</td><td>抵抗モードで使用し、TER測定中はプラグを抜いたままにします</td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td><td>MEARIENFELD</td><td>610610</td><td>血球計算盤&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCS_SP5_MO</td><td>Leica</td><td>Without/number</td><td>レーザー共焦点顕微鏡 Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>蛍光用封入剤</td></tr><tr><td>4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール (Dapi)</td><td>SIGMA</td><td>D-9542</td><td>0.05 mM 最終濃度</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A-1310</td><td>0.5%&nbsp; ブロッキング溶液の最終濃度</td></tr></tbody></table>

プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

赤痢アメーバは、人間のアメーバ症の原因物質、下痢や熱帯諸国における肝膿瘍の主要な原因である。感染は、腸上皮細胞と病原体との相互作用によって開始される。この相互作用は、このようなタイトジャンクショ​​ン（TJ）のような細胞間構造の破壊につながる。 TJは、腸管内腔から宿主組織を分離する上皮層のシール性を確保。最近の研究では、寄生タンパク質EhCPADH112によるTJの破壊がEのための前提条件であるという証拠を提供上皮バリア機能障害を伴うアメーバ侵入 。このように、E.中にTJ分解に関与する分子メカニズムの解析アメーバの侵入はアメーバ症の病因の理解を向上させるために最も重要である。この記事では、最初の宿主 - 病原体相互作用の評価と寄生虫の侵入の可能性を可能にする簡単なモデルを提示。分析対象となるパラメータは、Tが含まれransepithelial電気抵抗、上皮表面受容体発現の変化および上皮接合マーカーおよび上皮細胞内寄生生物分子の局在化の局在化との相互作用EhCPADH112。

成功のためのE.アメーバ文化 、二つの重要な条件が満たされなければならない：対数期における無菌状態や収穫を増加します。 Eの以前に、文化アメーバは容易に細菌やtrypanosomatids 22の特定の種に関連して設立された。しかし、今では、細菌、真菌、原生動物、または後生動物の細胞を代謝しない環境にアメーバの無期限継代培養を意味するこの寄生虫の無菌栽培が一般的です。さらに、増殖の初期静止期まで後半対数の間に栄養型を収穫することは実行可能で増殖している細胞23を持っていることが重要です。したがって、数日沿っおよびそれらのインタクト形態および迅速な移動（ 図1）を検査することによって栄養の定量によって、このフェーズを区別することが重要である。 相互作用研究のために、上皮細胞は、である必要がアメーバは通常、体内で遭遇する生理的条件を表すために、コンフルエントな単層内。いくつかの上皮細胞系、栽培しやすい、ご利用いただけます。より生理学的な細胞モデル系、例えば...

赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 - 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 - 病原体相互作用を評価するためのモデルを提供します。

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

この手順の全体的な目的は、初期の宿主病原体相互作用およびTBA.Histolyticaの侵入能を評価することです。まず、無傷の栄養体、栄養体、全溶出液、または栄養体分泌物の調製を行います。次に、適切な濃度の各種栄養体とともに、宿主上皮細胞をインキュベートします。次に、AM免疫蛍光法を用いて、処理した上皮培養細胞を解析し、上皮細胞のタイトジャンクションと相互作用する特定のABA histolyticaタンパク質を分析します。また、経上皮電気抵抗（TEER）によってパラセルラーバリアの変化を測定します。これらの結果を総合することで、TBA Histolyticaによるタイトジャンクションの分解を実証し、さらにこのプロセスにおける特定の複合体の関与を特定することができます。本手法の主な利点は、寄生虫の異なる産物を用いて、ホスト上皮へのEva histo因子の移行を評価できること、およびこれらのevaの関与を実証できることです。感染のごく初期段階における全細胞の接合部開口に関する要因。この手法は、上皮細胞とdiva isli寄生虫の間の分子相互作用の理解など、アメーバの浸潤分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、適切なインキュベーション時間や共インキュベーションにおける2種類の細胞の比率、また、異なるELI産物の取得方法およびTERの測定方法が分からず、苦労することがあります。この手法の意義は、E-H-C-P-A-D-H 112 complexのようなウイルス因子が新しい治療戦略の標的として利用できる可能性があるため、アミロイドの治療法にまで及びます。また、このin vitro法は、初期の宿主部位との相互作用におけるAnicaウイルス因子の関与について知見を提供します。さらに、in vivoでのハムスター、マウス、モルモットを用いた感染モデルや、ヒトの腸管生検などの他のシステムにも適用可能です。培養。MDCK細胞を、5% 二酸化炭素、37 °C の条件下で、10 mL の補完済み DMEM 培地にて培養します。1 × 10⁵ 個の Entamoeba histolytica トロフォゾイトを、37 °C で 15 mL の TYIS 33 培地を用いて正しく増殖させます。トロフォゾイトを剥離させるため、チューブを氷水バスで 5 〜 10 分間冷却します。次に、培養液を無菌的にコニカルチューブに移し、4 °Cで360 ×g、10分間遠心分離します。その後、上清を慎重にデカンテーションで除きます。ペレットに氷冷したPBSを加え、チューブを数回反転させて、遠心分離後の細胞を分散させます。ヘモサイトメーターを用いてトロフォゾイト数を算出し、トロフォゾイトを溶解させます。液体窒素で1分間急冷し、4 °Cで融解させた後、激しくボルテックスします。次に、0.02% β-メルカプトエタノールを用いて、溶解液中に存在するプロテアーゼを活性化させます。9 × 10⁶ 個のトロフォゾイトを3 mLの氷冷PBSで希釈し、細胞を50 mLコニカルチューブに移します。次に、分泌物を回収するため、tropho懸濁液を37 °Cのインキュベーター内で水平から5度傾けた状態で2時間静置し、チューブを360 ×gで10分間遠心分離します。使い捨ての滅菌シリンジを用いて、ペレット中のトロフォゾイトによるサンプルの汚染を避けながら、慎重に上清を回収してください。その後、混入した細胞を除去するため、上清を0.22 µmの酢酸セルロース膜でろ過します。次に、免疫蛍光染色の培養に向けて、0.02% beta mercaptoethanolでプロテアーゼを活性化させます。24ウェルマルチウェル細胞培養ディッシュ内の滅菌済みガラスカバーのスリップ上にMDCK細胞を播種します。倒立顕微鏡で細胞を観察し、コンフルエンスが100%に達するまで待ちます。1 mLの温めたPBSで希釈した、異なる条件のトロフォゾイトを添加します。PBSのみでE. histolyticaを含まないMDCK細胞のコントロール条件、および一次抗体によるインキュベーションを省略した、異なる条件のトロフォゾイトを加えたMDCK細胞のコントロール条件を含めます。培養プレートをインキュベーターに入れ、2分間または30分間インキュベートします。次に、未結合の分子や栄養体を除去するため、上皮細胞を冷たいPBSで5回洗浄します。加湿チャンバー内で、1 mLの96%エタノールを用いて-20 °Cで数分間、細胞の固定と透過処理を行います。ウェルからカバーガラスを慎重に取り出します。ろ紙を用いて縁から余分な液体を取り除き、細胞面を下にしてカバーガラスを0.5%BSAブロッキング溶液に浸します。サンプルを室温で1時間インキュベートします。その間に、PBSで一次抗体混合液を調製します。カバーガラスをブロッキング液から取り出します。フィルターペーパーで余分な液体を拭き取ります。細胞を抗体溶液に移し、4 °Cで一晩インキュベートします。未結合の分子を除去するため、1 mLのPBSで細胞を5回洗浄します。次に、2種類の蛍光二次抗体をPBSで混合して調製します。核染色を行うため、サンプルを二次抗体とともに室温・暗所で1時間インキュベートします。0.05 millimolarのdappy溶液200 µLを用い、室温・暗所で3分間細胞をインキュベートします。次に、共インキュベーション実験において、共焦点顕微鏡を用いてZスタックセクションおよびXZ平面で調製物を解析します。プロテアーゼ阻害剤または特異的抗体を用いて、各実験条件をプロテアーゼ阻害剤またはモノクローナル抗体培養液とともに4 °Cで20分間インキュベートします。滅菌済みのトランスウェル透過性サポートの上段コンパートメントにMDCK細胞を播種し、細胞懸濁液を100 µL分注し、下段コンパートメントにサプリメント添加DMEM培地を600 µL分注します。準備したトランスウェルフィルターを、倒立顕微鏡を備えたインキュベーター内に設置します。細胞が100%コンフルエントであることを確認してください。各トランスウェルの上部コンパートメントから培地を回収してまとめ、この培地混合液を50 µL分取します。ここに50 µLのトロフォゾイト懸濁液またはPBSコントロールを添加します。次に、これらの混合液をMDCK細胞を含む各トランスウェルの上部チャンバーに移します。STXの2本の電極をそれぞれのトランスウェルにすぐに浸し、経上皮電気抵抗を測定します。長い方の電極が下室の底部に接触し、短い方の電極が上室の培地に浸かっていることを確認してください。E histolyticaは指数増殖期の後半から定常期の初期に、適切な条件下で培養し、回収しました。ここでは、密着結合および接着結合によって安定化された上皮細胞の細胞間接触を可視化するために、密着結合マーカーであるZO-1を使用しました。単クローン抗体を用いた免疫蛍光染色により、アメーバ由来複合体と上皮表面との相互作用を検討しました。栄養形、全ライセート、または分泌産物を上皮単層に適用した結果、複合体と密着結合の共局在が認められました。30分後には、細胞境界におけるZO-1染色の不連続化と、小胞への内部移行が認められました。この破壊は、MDCK細胞とトロフォゾイトの接触部位において最も顕著でした。全細胞溶解物の共焦点レーザー顕微鏡観察では、病原性複合体が細胞間隙に向かって浸透していることが示されました。これは、破壊されたZO-1染色の寄生虫接触部位と共局在し、上皮バリア機能を破壊し、経上皮電気抵抗（TEER）の90%低下をもたらしました。トロフォゾイトを複合体に対する抗体またはプロテアーゼ阻害剤で前インキュベーションしたところ、TERの低下が抑制されました。これらのデータは、E. histolyticaの浸潤において、この複合体のプロテアーゼ活性と接着特性の両方が重要な病原性因子であることを示唆しています。このビデオを視聴することで、E. histolyticaの病原性因子が感染初期にタイトジャンクションを開口させるメカニズムをどのように分析するかについて、十分に理解できるはずです。この分析を習得すれば、解析産物と細胞培養の準備が整っている場合、上皮損傷の解析を3時間で完了させることができます。この手順を行う際は、イオンの正確な相互作用時間を遵守することが重要です。本手順の完了後、*E. histolytica*の病原性因子と上皮タンパク質の間の潜在的な関連性など、さらなる疑問を解消するために、免疫沈降法などの他の手法を実施することができます。この技術は、アルサイド相互作用分野の研究者が、ハムスター、マウス、モルモット、およびヒト組織におけるAMSの病原性を探索するための道を開きました。

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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プロデュース上皮損傷の解析

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