Name: Ein Protokoll zum Infect Caenorhabditis elegans Mit Salmonella typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Lernen Sie ein Infektionsprotokoll für C. elegans mit Salmonella typhimurium zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Diese Methode nutzt RNAi zur Genfunktionsanalyse und ermöglicht die Identifizierung schützender Gene.

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Wir danken Dr. Diane Baronas-Lowell für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant und einer alternden Stipendium der Ellison Medical Foundation unterstützt KJ

1. XLD (Xylose-Lysin Desoxycholate) Agar-Platten XLD-Agar ist ein Selektivwachstumsmedium für Salmonellen, die als schwarze Kolonien auf XLD-Agar-Platten erscheint. Falls jedoch keine Bedenken der Verunreinigung kann eine regelmäßige LB-Platte ersetzt werden. <ol><li> Abwiegen 5,5 g XLD-Agar und Resuspension in 5 ml VE-Wasser. </li><li> Gut mischen, bis alle Agar nass ist. In 95 ml VE-Wasser, bis alle Klumpen verschwunden sind und das Medium wird vollständig suspendiert. </li><li> Kochen Sie die mittel-bis vollständig auflösen (nicht autoklavieren). </li><li> Kühlen des Mediums bei Raumtemperatur bis 50 ° C. </li><li> Gießen in 25 ml Agar je 95 x 15 mm (Durchmesser x Höhe) Platte (Platten mit Parafilm verschlossen bei 4 ° C für bis zu 1 Monat gelagert werden.) </li></ol> 2. Nematode Growth Medium (NGM) RNAi Fütterungsplatten Vorbereitung von C. elegans NGM-Platten wurde bereits beschrieben 19. Hier wird ein Verfahren kurz beschrieben, um das Antibiotikum Ampicillin und die RNAi chemischen Induktors Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in die NGM-Medien zu den RNAi Vorschubplatten zu machen. <ol><li> Lösen Sie 3 g NaCl und 2,5 g Bacto Pepton in 1 L VE-Wasser. </li><li> In 17 g Bacto-Agar in die Medien. </li><li> Autoklavieren das Medium für 45 Minuten und kühlen die Medien auf 50 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Fügen Sie die folgenden Lösungen: 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in 95% Ethanol), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4 und 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0). Gut mischen. </li><li> 1 ml 1 M IPTG und 500 ul Ampicillin (100 mg / ml in sterilem Wasser). </li><li> Mischen Sie die Lösung gut vermischen und in 60 x 15 mm (Durchmesser x Höhe) Petrischalen mit einer Pipette Hilfe und 25 ml serologische Pipette folgende sterile Verfahren. Füllen Sie jede Platte mit 12 ml Agar. Platten können bei 4 ° C für bis zu 1 Monat gelagert werden. </li></ol> Der wesentliche Autophagie-Gen bec-1 wird als Beispiel verwendet, um die Funktion eines Gens Gastgeber in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen. Die Versuchsverfahren sind in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Das Protokoll für die Herstellung von RNAi-behandelten Tieren Infektion folgt, mit dem Tag der einzelnen Versuchsschritt in Klammern angegeben. <ol><li> Impfen bec-1 RNAi Fütterung und Kontrolle leeren Vektor L4440 RNAi Fütterung Bakterien, indem eine Flocke von -80 ° C eingefroren Bakterien in 2 ml LB-Medium mit 100 mg / ml Ampicillin (Tag 1) ergänzt. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal pro Woche während des gesamten Experiments an die frische RNAi Bakterien haben. Bewahren Sie die Kultur in der 4 ° C Kühlschrank, wenn nicht verwendet. </li><li> Seed 100 ml Bakterienkultur über Nacht auf RNAi RNAi-Platten. Bereiten Sie drei bec-1-RNAi und drei Steuer leer vECTOR RNAi-Platten. Die Inkubation bei 37 ° C über Nacht (Tag 2). </li><li> Entfernen Sie die RNAi-Platten aus dem 37 ° C-Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur auf der Bank abkühlen. Pick-up wohlgenährten L4 Wildtyp N2 Hermaphroditen und übertragen Sie sie auf bec-1-RNAi und steuern leeren Vektor RNAi-Platten. Platzieren Sie drei Würmer pro Platte, dreifach auf Platten. Am gleichen Tag, bereiten RNAi-Platten, wie in Schritt 3.2 (Tag 3) beschrieben. </li><li> Die RNAi-Platten inkubieren mit Würmern in der 20 ° C-Inkubator für 36-40 Stunden und Transfer Würmer an die frische entsprechenden RNAi-Platten in Schritt 3.3 vorbereitet. Nach Würmer übertragen werden, brüten die Platten in der 20 ° C-Inkubator für 64 h (Tag 4). </li></ol> 4. Bereiten Salmonellen für Infektions <ol><li> Streak Salmonellen -80 ° C eingefroren Lager auf 1 XLD-Agar-Platte und Inkubation der Platte bei 37 ° C über Nacht (Tag 5 </strong&gt;). </li><li> Wählen Sie eine gut isolierte Kolonie und schwarz Salmonellen impfen es in 2 ml LB-Medium bei 37 ° C mit Schütteln über Nacht (Tag 6). </li><li> Seed 80 ml ​​Salmonella-Nacht-Kultur auf 1 C. elegans 60 x 15 mm (Durchmesser x Höhe) NGM-Agar-Platte und bereiten 6 Platten insgesamt. Die Inkubation bei Raumtemperatur für 6 Stunden. Die Bakterienkultur sollte trocknen und eine Rasenfläche auf der Platte (Tag 7). </li></ol> 5. Infect RNAi-behandelten Worms mit Salmonellen <ol><li> Übertragen bec-1 RNAi-behandelten und unbe leeren Vektor RNAi-behandelten L4 N2 Hermaphroditen (Nachkommen von Würmern in Schritt 3), um Salmonellen-Platten. Die 40 Würmer pro Platte auf 3 Platten für jede Gruppe. Die Schnecken Platten bei 20 ° C für 48 Stunden (Tag 7). </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von frischen RNAi-Platten wie in den Schritten 3.1 und 3.2 (Tag 7 beschrieben und <strong&gt; Tag 8). </li><li> Nach 48 Stunden Infektion übertragen Salmonellen-infizierten Würmer zu den entsprechenden RNAi-Platten in Schritt 5.2 vorbereitet und Inkubation bei 20 ° C (Tag 9). </li></ol> 6. Survival-Assay <ol><li> Stand das Überleben der Würmer täglich und übertragen Würmer an die frische entsprechenden RNAi-Platten während der Eiablage-Zeit. Einen Satz von frischen RNAi-Platten vor jeder Wurm Transfer wie in den Schritten 3.1 und 3.2 beschrieben. Tippen Sie auf das Schneckenkörper (Kopf, Mittelteil und Schwanz) vorsichtig mit einem Ende abgeflachten Platindraht. Eine Schnecke wird als tot gezählt, wenn keine Bewegung des Schneckenkörpers beobachtet. </li><li> Stand das Überleben der Würmer täglich oder jeden zweiten Tag, und übertragen Würmer an die frische entsprechenden RNAi-Platten zweimal pro Woche nach Würmern zu stoppen, Eier zu legen. </li><li> Nachdem alle Würmer sterben, bündeln die Überlebensdaten aus Dreifachplatten als ein Datensatz. Geben Sie die Überlebensdaten der jeweiligen Gruppe in geeigneter statistischer Software wie GraphPad Pmus, um Überlebenskurven zu generieren und Kaplan-Meier-Überlebensanalyse durchzuführen. Der gesamte Versuch wird mindestens einmal, um den Abschluss zu bestätigen wiederholt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

C. elegans ist eine einfache genetische Modellorganismus, die Bakterien als Nährstoffquelle isst. Somit ist es einfach, seine normale Bakteriennahrung mit einer Darmerreger ersetzt, um die Wechselwirkungen zwischen C untersuchen elegans und das Pathogen ausgewählt. Hier ein Protokoll beschrieben, um Salmonellen-Infektion und C verbinden elegans RNAi Fütterung Behandlung, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuche...

Die frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans Boden ist eine einfache und genetisch manipulierbaren Modellorganismus verwendet, um viele biologische Fragestellungen zu untersuchen. C elegans besteht überwiegend als selbstDünge Hermaphroditen. Männer sind spontan von Nicht-Trennung von dem X-Chromosom während gametogenesis 1,2 erzeugt. In Anwesenheit von reichlich Nahrung, C. elegans kontinuierlich über vier Larvenstadien zum Erwachsenen zu entwickeln. Temperatur beeinflusst auch C. elegans Entwicklung; schnellere Entwicklung bei höheren Temperaturen beobachtet. Im Labor C. elegans ist bei einer Standardtemperatur von 20 ° C auf Agar-Platten mit ausgesät Bakterium Escherichia coli (Stamm OP50) als Lebensmittel 1,2 kultiviert. In den letzten zehn Jahren, C. elegans wurde als wirbellosen Organismus, Wirt-Pathogen-Interaktionen zu studieren 3-5 entstanden. In der Natur, C. elegans frisst Bakterien als nutrient 1,2 Quelle. Seine normale bakterielle Labor Essen, OP50, kann leicht mit anderen Krankheitserregern ersetzt werden, um die Wechselwirkungen zwischen C untersuchen elegans und jede gewählte Erregers. Unter diesen Bedingungen ist der Darm der primäre Ort der Infektion. In der Tat, eine breite Palette von bakteriellen Krankheitserregern hat sich gezeigt, tödlich infizieren C. elegans 3-5. Das gram-negative Bakterium Salmonella ist ein Magen-Darm-Erreger, der menschlichen Lebensmittelvergiftungen verursacht weltweit 6,7. C elegans ist ein gutes Modell für die Host-Salmonella typhimurium, wie dieses Bakterium repliziert und zeigt anhaltende Darminfektionen 10.08. C elegans wurde verwendet, um sowohl neue als identifizieren und bisher bekannten Salmon Virulenzfaktoren 11. Interessanterweise ist die C elegans Immunsystem erfolgreich begrenzt Salmonellen-Replikation. Es wurde bereits berichtet, dass INHIBition der Autophagie-Gene macht erhöhte Salmonella-Replikation in C. elegans, was zu frühen Tod der infizierten Würmer 10. Makroautophagie (hierin als Autophagie bezeichnet) ist ein dynamischer Prozess, der die Neuanordnung der subzellulären Membranen Zytoplasma und Organellen für die Lieferung an den Lysosomen zum Abbau 12 zu maskieren. Autophagie wurde berichtet, dass die Salmonellen-Replikation in C zu begrenzen elegans und bei Säugetieren 10,13. Die C. elegans Genoms war der erste mehrzellige eukaryotische Genom sequenziert; es reagiert auf RNAi-Behandlung 14-16. Außerdem kann RNAi effektiv, indem Würmer, Bakterien, die den doppelsträngigen RNA des Zielgens, wie RNAi Fütterung 16,17 bekannt einnehmen verwaltet werden. Gesamte Genom RNAi Fütterung Bibliotheken für genomweite RNAi Screening 16,18 generiert. Hierbei wird eine Salmonellen-Infektion proProtokoll ist mit RNAi-Zuführung zum Testen C erlauben gekoppelt elegans Gene von Interesse für ihre Fähigkeit, gegen Salmonellen-Infektion zu schützen.

<table><tbody><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD Agar</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 60 x 15 mm&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serologische Pipette</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 Schüttelinkubator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll zum infect<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; mit<em&gt; salmonella typhimurium</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In den letzten zehn Jahren, C. elegans wurde als wirbellosen Organismus, um Wechselwirkungen zwischen Hosts und Krankheitserregern zu untersuchen entstanden, einschließlich der Wirtsabwehr gegen gram-negative Bakterium Salmonella typhimurium. Salmon stellt eine persistierende Infektion im Darm von C. elegans und führt zu frühen Tod der infizierten Tiere. Eine Anzahl von Immunitätsmechanismen in C identifiziert elegans gegen Salmonellen-Infektionen zu verteidigen. Autophagie ist ein evolutionär konservierten lysosomalen Abbauweg, wurde gezeigt, dass die Salmonellen-Replikation in C zu begrenzen elegans und in Säugern. Hier ist ein Protokoll beschrieben, um C zu infizieren elegans mit Salmonella typhimurium, wobei die Würmer zu Salmon für eine begrenzte Zeit, ähnlich wie Salmonella-Infektion beim Menschen ausgesetzt. Salmonella-Infektion signifikant die Lebensdauer verkürzt C. elegans &lt;/ Em&gt;. Mit den wesentlichen Autophagie-Gen bec-1 als Beispiel kombinieren wir diese Infektion mit C. Verfahren elegans RNAi Fütterung Ansatz und zeigte dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktion von C zu untersuchen elegans Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion. Da C. elegans gesamte Genom RNAi-Bibliotheken zur Verfügung stehen, macht es möglich, dieses Protokoll umfassend Bildschirm für C. elegans Gene, die gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger zu schützen, die Darmgenomweiten RNAi-Bibliotheken.

Bei 20 ° C ist die mittlere Lebensdauer von Wildtyp N2 Würmer 17 Tage (Abbildung 2A und Tabelle 2). Salmonellen-Infektion deutlich auf 10,5 Tage verringert die mittlere Lebensdauer der Würmer N2 (p = 0,0002, Log-Rank-Test) (2A ). Wenn ein C elegans Gen spielt eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion, wird vorhergesagt, dass seine Hemmung wird die Anfälligkeit für Salmonellen-Infektion...

C. elegans hat als neues genetisches Modell zur Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen entstanden. Hier sind wir zu C infizieren beschreiben ein Protokoll elegans mit Salmonella typhimurium in Verbindung mit dem Doppelstrang-RNAi-Interferenz-Technik, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen.

Ein Protokoll zum Infect<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Mit<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Elegans mit Salmonellen zu infizieren, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Expression eines Wirtsgens durch RNAi gehemmt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, mit RNAi behandelte Würmer mit Salmonellen zu infizieren.Die Infektion wird gestoppt, indem die infizierten Würmer auf nicht-pathogene rna eye-Fütterungsplatten überführt werden. Die letzten Schritte bestehen darin, das Überleben der infizierten Würmer zu dokumentieren. Berechnen Sie die Überlebensrate anhand dieser Daten und identifizieren Sie letztendlich Gene, die für den Schutz gegen Salmonella essentiell sind.Julie John, eine Technikerin aus einem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der erforderlichen Kultivierungsplatten. Stellen Sie zunächst XLD-Agarplatten her.Sie sind selektiv für Salmonellen, die auf diesen Platten als schwarze Kolonien erscheinen. Stellen Sie sicher, dass Sie XLD-Agar vor dem Mischen mit dem vollen Wasservolumen in Wasser bei einer Konzentration von einem Gramm pro Milliliter resuspendieren. Nicht autoklavieren.Dieses Agar wurde gerade mi

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell . J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert einen Überlebenstest mit C. elegans , um die Pathogenese von Aeromonas zu modellieren, bei der die orale Aufnahme der Bakterien zu Darminfektionen und Sterblichkeit führt und so eine quantitative Bewertung der bakteriellen Virulenz in einem lebenden Wirtssystem ermöglicht.

Modellierung der Aeromonas-Pathogenese bei C. elegans mit einem Überlebenstest

Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.

Die Züchtung Caenorhabditis elegans In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Zebrafisch (Danio Rerio) immer eine weit verbreitete vertebrate Tiermodell für mikrobielle Besiedlung und Pathogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Protozoen Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektion im Zebrafischlarven. P. Caudatum leicht internalisiert Bakterien und bekommen von Larven Zebrafisch durch natürlichen Jagd Verhalten aufgenommen.

Mit dem Protozoon Paramecium Caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektionen im Zebrafisch-Larven

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Salmonellen-getriebenen Darmfibrose, die den wichtigsten pathologischen Merkmalen der Morbus Crohn ähnelt, einschließlich transmuraler Entzündungen und Fibrose. Diese Methode kann verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu bewerten, die fibrotische Ergebnisse mit mutierten Mäusen verändern, die auf einem c57Bl/6 genetischen Hintergrund gehalten werden.

Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose

Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Hochdurchsatz-Workflows für die Wurmkultivierung, Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildverarbeitung zur Quantifizierung von Polyglutaminaggregaten als Bewertung von Veränderungen der Proteostase.

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Darmmikroben können die Gesundheit ihres Wirts über spezifische oder konservierte Mechanismen positiv oder negativ beeinflussen. Caenorhabditis elegans ist eine bequeme Plattform, um nach solchen Mikroben zu suchen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Screening von 48 Bakterienisolaten auf Auswirkungen auf die Nematoden-Stressresistenz, die als Proxy für die Gesundheit von Würmern verwendet werden.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

Lernen Sie ein Infektionsprotokoll für C. elegans mit Salmonella typhimurium zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Diese Methode nutzt RNAi zur Genfunktionsanalyse und ermöglicht die Identifizierung schützender Gene.

Ein Protokoll zum Infect

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