Name: Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Изучите анализ фокус-образования для оценки онкогенного потенциала генов с использованием клеток NIH 3T3. Этот метод помогает исследователям выявлять трансформирующую способность генов in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантом из Нью-Новатор программы по присуждению директора NIH (ЭД). АА частично поддержана студентов награды от Национального института рака и Национального научного фонда.

1. Создание вирусных векторов Кодирующие последовательности для интересующего гена, а также положительных и отрицательных контролей, которые вставлены в pBABEpuro традиционными методами клонирования (ПЦР-амплификации, ограничение и лигирования). Существуют четыре сайты рестрикции на векторе, где ДНК могут быть вставлены: BamHI, SnaBI, EcoRI и SalI. <ol><li> Подготовка трансфекции-класса плазмидной ДНК из компетентных клеток с использованием плазмиды миди набор QIAGEN. </li><li> Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop2000. </li></ol> 2. ретровируса Производство Plat-E упаковка клеточная линия будет использоваться для получения экотропного ретровируса, который будет доставлять кДНК интерес для клеток NIH-3T3. <ol><li> Создание Плат-E культур из замороженных клеток <ol><li> Быстро оттаивают Plat-E клеток в ° С на водяной бане при 37 и передавать в 15 мл коническую трубку. Медленно добавьте 9 мл Плат-E среды (Дуlbecco в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + пенициллина и стрептомицина). </li><li> Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант. </li><li> Повторное приостановить клетки с 10 мл Plat-E среды и передачи в 10 см чашки для культивирования. </li><li> Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе, пока они не 80-90% сливной (около 2 дней). </li></ol></li><li> Сотовый Разделение <ol><li> Аспирируйте среды и мыть клетки один раз PBS. </li><li> Добавить 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре. </li><li> Открепления клеток от палец нажатие, добавить 10 мл Plat-E среды, и передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку. </li><li> Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант. </li><li> Ресуспендируют клеток с 10 мл Plat-E среды и семян их в новые чашки 1: 4-1: 6 разведений. </li></ol></li><li> Плат-E Посевная и Трансфекцию <ol><li> Семена 2 × 10 6клеток на 10 см блюдо культуры с использованием Плат-E среду без каких-либо антибиотиков. </li><li> Инкубируйте клетки O / N в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. </li><li> На следующий день, передача 300 мкл Opti-MEM в 1,5 мл пробирке. </li><li> Добавить 27 мкл полиэтиленимина (PEI), экономически эффективный реагента для трансфекции 12, на подготовленную трубу с Opti-MEM. Осторожно перемешать пальцем разговоров и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Добавить 9 мкг трансфекции класса плазмидной ДНК в OPTI-MEM / PEI трубки, осторожно перемешать на вортексе и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. </li><li> Добавить ДНК / ПЭИ комплекс по каплям в Plat-E блюдо и инкубировать O / N при 37 ° С, 5% СО 2. </li><li> На следующий день, аспирации среду, содержащую реагента для трансфекции и добавить 10 мл свежей Плат-E среды (без антибиотиков). </li><li> Вернуться клеток в инкубатор. </li></ol></li></ol> 3. NIH 3T3, и инфекции <ol><li> Создание NIH3T3 Культуры и посев <ol><li> Быстро оттаивают NIH-3T3 клеток в ° С на водяной бане при 37 и передавать в 15 мл пробирку. Медленно добавляют 9 мл NIH-3T3 среде (DMEM + 10% FBS). </li><li> Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант. </li><li> Ресуспендируют клеток с 10 мл NIH 3T3 среды и перенести в 10 см блюдо культуры. </li><li> Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Очень важно, что NIH 3T3, всегда хранятся underconfluent (50-60%), так как частота спонтанного преобразования (и, следовательно, базальных уровней фокусов формирования) увеличивает когда культура достигает слитности. </li><li> Семя 3 х 10 5 клеток на 10 см чашку и инкубировать O / N для инфекции следующий день. </li></ol></li><li> Инфекция <ol><li> Урожай ретровирусный супернатант от Plat-E тарелки с помощью 10 мл одноразовый шприц, фильтрации его через нейлон размер мембранный фильтр 0,45 мкм пор, и передачи его в 15 млтруба. </li><li> Добавить 10 мл свежего Плат-E среды к клеткам (без антибиотиков), и вернуть их в инкубатор. </li><li> Аспирируйте среду от клеток NIH-3T3 блюдо быть заражены, и добавляют 5 мл регулярной NIH-3T3 среды и 5 мл, содержащих вирус отфильтрованной надосадочной жидкости. </li><li> Добавить полибрена к чашке с концентрацией 6 мкг / мл. </li><li> Инкубируйте клетки O / N при 37 ° С, 5% СО 2. </li><li> На следующий день повторите шаги 3.2.1 - 3.2.5 для второго раунда инфекции. </li><li> Заменить Содержащую вирус среду с регулярным NIH-3T3 среды. </li><li> Разрешить клетки NIH-3T3 культивировали в течение 2-3 недель, заменяя среду по мере необходимости. Проверка экспрессии интересующего белка с помощью обычного электрофореза белков и иммуноблоттинга на целых клеточных лизатов из реплик пластин. </li></ol></li></ol> 4. Окрашивание и количественного <ol><li> Кристалл Фиолетовый Окрашивание <ol><li> Аспирируйте среду NIH 3T3 и поместите посудуна льду. </li><li> Мыть посуду в два раза с ледяной PBS. </li><li> Зафиксировать клетки с ледяной метанола в течение 10 мин. </li><li> Удалить посуду из льда, аспирации метанола и добавляют 3 мл 0,5% -ного раствора кристаллического фиолетового, сделанные в 25% метаноле (RT). </li><li> Инкубируйте блюда в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Аспирируйте кристаллическим фиолетовым решение и тщательно промыть блюдо с Milli-Q H 2 O, пока цвет не сходит при полоскании. </li><li> Разрешить блюда высохнуть O / N на настольной (непокрытый). </li></ol></li><li> Очаги Количественное <ol><li> После того, как блюда в сухом, используйте линейку, чтобы измерить потемневшие коллекции клеток на пластине. Только рассчитывать те, которые больше, чем 5 мм в диаметре, как &quot;очагов.&quot; Записать число очагов и рассчитать средние и значение по сравнению с контрольной группой. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

FFA обеспечивает быстрый и простой способ оценить злокачественной трансформации в пробирке. Это поддается скрининга относительно большого количества генов-кандидатов, и его скромные технические требования делают рентабельным. Кроме того, два или более генов может быть совместной экспрессии (иногда упоминается как &quot;сотрудничество&quot; анализа) для оценки онкогенного потенциала в сочетании. Преимущества этого анализа опираться на его простой техники, простотой количественного и его сравнительно короткий вре...

Опухолевые клетки можно отличить от их нормальных аналогов широким диапазоном изменений, из форм генной экспрессии в Epigenomics в морфологических и пролиферативных изменений. Среди последних, уменьшение зависимости от сыворотки, потеря контакта (плотности) торможения, приобретение крепления независимой пролиферации и, в конечном счете, способность образовывать опухоли при введении животным полезны, измеримые показатели злокачественной трансформации 3. Несколько в пробирке и в естественных условиях анализов были разработаны для трансформации клеток. В пробирке анализы направлены на выявление и измерение изменений в области культуры морфологии (образование анализа фокус), динамики культуры (темп роста, плотность насыщения) и фактор роста (рост в восстановленной сыворотки) или якорь (рост на мягком агаре) требованиям. Золотой стандарт для определения злокачественной природы клеток определенного типа, остается формирование опухоли (ксенотрансплантаты) у экспериментальных животных. Тем не менее, тон стоит и продолжительность обучения в естественных условиях не всегда делают их оправдано в качестве первого этапа проверки или досмотра кандидатов онкогенов. Хотя ни анализ в пробирке не дает определенную оценку онкогенного потенциала гена, они дают полное представление онкогенного потенциала, который может сузить будущее в естественных условиях исследования. Одним из наиболее широко используемых систем для оценки онкогенного потенциала в пробирке находится в центре внимания Формирование Анализ 2. Этот подход основан на использовании NIH-3T3 мыши фибробластов, не-трансформированной клеточной линии, которая показывает сильное ингибирование контактной. Избыточная экспрессия онкогенов приводит к потере плотности в зависимости от роста; Трансформированные клетки можно затем растут в несколько слоев, образующих &quot;очаги&quot;, легко визуализировать на фоне монослоя нетрансформированных клеток. Фокус Формирование Анализ, то, измеряет способность кандидата онкоген, чтобы вызвать злокачественную трансформацию, о чем свидетельствует потеря контакта Inhibition как измеримое фенотипа. FFA был использован для оценки трансформации сверхэкспрессией протеинкиназ (например, Src 4, 5 BRAF), факторы транскрипции (например, N-Myc 6), G-белками рецепторы (например, P2RY8 7) и GTPases (например, Рас 1), среди прочих. Относительная простота этого теста делает его хорошим выбором, который обеспечит быстрый и визуально четкий ответ на ли избыточная экспрессия гена достаточно, чтобы превратить NIH 3T3 фибробластов мышей клетки в пробирке. FFA описано в данном протоколе используется Plat-E упаковка клеточную линию 8, который обеспечивает вирусные белки упаковки и ретровирусный вектор pBABEpuro 9 (Addgene плазмиду 1764), чтобы произвести ретровирус. После трансфекции с pBABEpuro конструкции, содержащей нужный ген, клеточная линия Plat-E будет производить экотропного ретровируса, который может быть использован для инфицирования клеток NIH-3T3. Tвирусная способ доставки генов является более эффективным, чем традиционные методы химической трансфекции и предлагает способ устойчиво экспрессировать ген 10. После того, как включается в геном клеток NIH-3T3, избыточная экспрессия интересующего гена приводится в действие вирусных длинные концевые повторы (LTR), промотор 11. Эта константа выражение может быть использовано для определения того, имеет ли интерес ген онкогенного активности, измеренной с образованием очагов на клетках NIH-3T3.

<table><tbody><tr><td>Вектор pBABE-puro</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>клонирование</td></tr><tr><td>вектор Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>RV-101</td><td>клеточная линия для производства вирусов</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Клеточная линия мыши</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>клеточная линия для анализа формирования фокуса</td></tr><tr><td>10 мл BD шприц с наконечником Luer-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>реагент для производства вирусов</td></tr><tr><td>0,45 мкм; m Puradisc Шприцевой фильтр</td><td>Ватман</td><td>6750-2504</td><td>вирусный реагент</td></tr><tr><td>полиэтиленимин (ПЭИ)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>реактив для трансфекции клеток</td></tr><tr><td>Полибрен Инфекция / Реагент для трансфекции</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>реактив для трансфекции клеток</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>реактив для окрашивания клеток</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>очистка плазмид</td></tr><tr><td>BD Falcon Tissue Culture Dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Материалы для клеточных культур</td></tr><tr><td>Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>среда для клеточных культур</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Материалы для клеточных культур</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>среда для клеточных культур</td></tr><tr><td>Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>среды для клеточных культур</td></tr></tbody></table>

Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Злокачественная трансформация клеток обычно связана с увеличением пролиферации, потерей ингибирования контакта, приобретением независимого от якоря потенциала роста и способностью образовывать опухоли у экспериментальных животных1. Известно, что в клетках NIH 3T3 путь передачи сигнала Ras запускает многие из этих событий, что известно как преобразование Ras. Введение сверхэкспрессированного гена в клетки 3T3 NIH может способствовать морфологической трансформации и потере контактного ингибирования, что может помочь определить онкогенный потенциал этого гена, представляющего интерес. Анализом, который обеспечивает простой метод оценки одного из аспектов трансформирующего потенциала онкогена, является анализ образования фокуса (FFA)2. Когда клетки 3T3 NIH делятся нормально в культуре, они делают это до тех пор, пока не достигнут сливающегося монослоя. Однако в присутствии сверхэкспрессированного онкогена эти клетки могут начать расти в плотных, многослойных очагах1, которые могут быть визуализированы и количественно оценены с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым или Hema 3. В этой статье мы опишем протокол FFA с ретровирусной трансдукцией интересующего гена в клетки NIH 3T3, а также способы количественной оценки количества очагов с помощью окрашивания. Ретровирусная трансдукция является более эффективным методом доставки генов, чем трансфекция, а использование экотропного мышиного ретровируса обеспечивает контроль биобезопасности при работе с потенциальными онкогенами человека.

MXD3 является основной спираль-петля-спираль лейцин молния (bHLHZ) транскрипционный фактор, который является членом MYC / MAX / MAD сети. Это нетипичный член MAD семьи 13-15 и было сообщено, участвуют в канцерогенезе 16,17. По сравнению с pBABEpuro (отрицательный контроль) и MYC (положительный контроль), блюда NIH-3T3, где MXD3 был избыточно экспрессируется было значительно меньше очагов (рис 1а). Данные в фиг.1В были собраны из нескольких опытов по определению зна...

Фокус Формирование анализ обеспечивает простой метод для оценки преобразующую потенциал кандидата онкоген.

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Общая цель данной процедуры — проведение анализа формирования фокусов на линиях фибробластов мыши с использованием ретровируса для определения онкогенного потенциала гена. Это достигается путем первоначального клонирования последовательности интересующего гена в ретровирусный вектор. Вторым этапом является получение ретровирусных частиц с использованием вирусного вектора и упаковочных клеток PLA e.Затем ретровирус используют для заражения фибробластов мыши линии NIH 3T3, чтобы оценить трансформирующий потенциал исследуемого гена. На заключительном этапе клеткам NIH 3T3 дают делиться в течение двух-трех недель, после чего проводят окрашивание кристаллическим фиолетовым для количественного определения числа образовавшихся фокусов. В конечном итоге анализ формирования фокусов используется для того, чтобы показать, достаточно ли гиперэкспрессии исследуемого гена для индуцирования плотностно-независимого роста в фибробластах мыши.Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, например, при скрининге онкогенного потенциала гена. Для начала приготовьте вирусный вектор согласно текстовому протоколу. Затем создайте культуры plat E из замороженных клеток, быстро разморозив клетки plat E в водяной бане при 37 °C, после чего перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл.Медленно добавьте 9 мл среды PLA E в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 180 ×g в течение пяти минут, затем удалите супернатант. Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды plat E и перенесите их в чашку для культивирования диаметром 10 см.Затем инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до достижения конфлюэнтности от 80 до 90%. Выполните пассирование клеток: сначала аспирируйте среду, затем один раз промойте клетки PBS, после чего добавьте 2 mL 0,05%трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре, отделив клетки легким постукиванием по стенкам сосуда. Затем добавьте 10 mL среды plat E и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 mL.Центрифугируйте пробирку, как и прежде, и ресуспендируйте клетки в 10 milliliters среды plat E. Затем высейте 2 million клеток в чашку для культивирования диаметром 10 centimeter, используя среду plat E без антибиотиков, и оставьте клетки для инкубации на ночь. На следующий день перенесите 300 microliters оптимиума в микропробирку объемом 1.5 milliliter.Добавьте 27 µL полиэтиленимина в подготовленную пробирку с Optum. Осторожно перемешайте, постукивая пальцем по пробирке, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте в пробирку 9 µg плазмидной ДНК степени чистоты для трансфекции, аккуратно перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.Затем по каплям добавьте смесь в чашку plat E перед инкубацией в течение ночи. На следующий день аспирируйте среду, содержащую реагент для трансфекции, и добавьте 10 мл свежей среды plat E, после чего верните клетки в инкубатор для создания культур NIH 3T3. Сначала быстро разморозьте клетки на водяной бане при 37 °C и перенесите их в пробирку объемом 15 мл.Медленно добавьте 9 мл среды NIH-3T3 к клеткам, центрифугируйте пробирку при 180 ×g в течение 5 минут и удалите супернатант. Затем ресуспендируйте клетки в 10 мл среды NIH-3T3 и перенесите их в культуральную чашку диаметром 10 см. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2, не допуская достижения полной конфлюэнтности, так как это повышает частоту спонтанной трансформации.Когда культура достигнет конфлюэнтности, высейте 3×10⁵ клеток 3T3 в чашку Петри диаметром 10 см и инкубируйте в течение ночи перед заражением на следующий день. На следующий день соберите ретровирусный супернатант из чашки Петри с помощью одноразового шприца объемом 10 мл, профильтруйте его через нейлоновый мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и перенесите в пробирку объемом 15 мл. Перед возвращением клеток в инкубатор добавьте к ним 10 мл свежей среды для клеток plat E.Затем аспирируйте среду из чашки с клетками NIH 3T3, предназначенной для инфицирования, добавьте 5 мл стандартной среды для клеток NIH 3T3 и 5 мл фильтрованного супернатанта, содержащего вирус. Затем добавьте в чашку полибрейн в концентрации 6 мкг/мл.Инкубируйте клетки в течение ночи, прежде чем повторить этапы инфицирования для второго раунда инфекции. После инфицирования замените вируссодержащую среду на обычную среду IH 3T3. Дайте клеткам IH 3T3 расти в течение двух-трех дней, при необходимости заменяя среду, перед окрашиванием кристаллическим фиолетовым.Отососите среду с клеток NIH 3T3 и поместите чашки на лед. Дважды промойте чашки ледяным раствором PBS. Зафиксируйте клетки ледяным метанолом в течение 10 минут.Затем извлеките планшеты из охлаждающего льда и аспирируйте метанол. Добавьте три миллилитра 0,5% раствора кристаллического фиолетового, приготовленного в 25% метаноле, и инкубируйте планшеты в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации аспирируйте раствор кристаллического фиолетового и осторожно промойте планшет водой Milli Q до тех пор, пока при промывке не перестанет вымываться краситель.Оставьте чашки открытыми для высыхания на лабораторном столе на ночь. После высыхания чашек с помощью линейки измерьте размер фокусов и подсчитайте те, диаметр которых превышает 5 мм; зафиксируйте полученное число. MXD3 представляет собой базовый транскрипционный фактор с доменом helix-loop-helix-leucine zipper, который является нетипичным представителем семейства MAD; согласно имеющимся данным, он участвует в канцерогенезе по сравнению с отрицательным и положительным контролем.В чашках с клетками NIH 3T3, в которых была гиперэкспрессирована MXD3, наблюдалось значительно меньшее количество фокусов. Данные были собраны в ходе нескольких экспериментов для определения статистической значимости, и в этом анализе наблюдались те же тенденции. Результаты позволяют предположить, что после данной процедуры MXD3 не функционирует как онкоген.Для получения дополнительных ответов при оценке роли интересующего гена в патогенезе онкогенеза можно использовать другие методы, такие как анализ фокус-образования с комбинациями генов, изучение пролиферации в мягком агаре и анализ клеточного цикла.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Это видео описывает анализ образования колоний мягкого агара для проверки влияния ингибитора фермента PADI и BB-Cl-амидина на опухолевую генность рака молочной железы in vitro. Этот анализ также позволяет количественно оценить потенциал трансформации клеток в контексте генетических возмущений.

Анализ образования колоний мягких агаров: метод проверки влияния новых соединений на пролиферацию раковых клеток

Это видео описывает анализ формирования колоний, который помогает определить способность клеток рака легких размножаться бесконечно и образовывать отдельные колонии. Мы можем проанализировать влияние противоопухолевого агента на колониеобразующие клетки, анализируя изменения в количестве и/или размере образующихся колоний.

Анализ колониеобразования: оценка эффективности противоопухолевых препаратов на колониеобразующих клетках рака легких

В этом видео описывается протокол для анализа колоний на основе метилцеллюлозы или КОЕ, который помогает идентифицировать и подсчитать количество колоний, образованных лейкозными клетками в ответ на лечение противораковыми соединениями.

Анализ КОЕ на основе метилцеллюлозы: метод определения влияния противораковых соединений на образование колоний в лейкозных клетках

Достижение понимания систем уровня клеточных процессов является целью современной клеточной биологии. Мы описываем здесь стратегий для мультиплексирования люциферазе журналистам различных клеточных функций конечными точками, чтобы допросить использованием функции гена генома РНК-интерференции масштабе библиотек.

Мультиплексированную Люциферазы скрининга на основе Платформы Допрос связанных с раком передачи сигнала в культуре клеток

Анализ образования колонии мягкого агара - это метод, используемый для подтверждения независимого от клеточного якоря роста in vitro. Цель данного протокола состоит в том, чтобы проиллюстрировать строгий метод обнаружения онкорогенного потенциала трансформированных клеток и опухолевого подавляющего воздействия белков на трансформированные клетки.

Формирование Анализ Soft Агар колонии

Определение новых мишеней для лекарств, которые переходят от доклинических испытаний к испытаниям на людях, является научным приоритетом. С этой целью мы описываем подход функциональной геномики для изучения влияния истощения генов на сфероиды раковых клеток, которые более адекватно моделируют рак человека in vivo.

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

Мы разработали новый протокол для изучения динамики гетероклеточной популяции в ответ на возмущения. В этой рукописи описывается платформа, основанная на изображениях, которая создает количественные наборы данных для одновременной характеристики множественных клеточных фенотипов гетероклеточных групп населения.

Дискриминация и характеристика гетеросекулярных групп населения с использованием методов количественной визуализации

Здесь мы описываем протоколы для проверки генетические и химические c-Fos и Dusp1 как цель наркотиков в лейкоз, с использованием модели в vitro и in vivo генетических и гуманизированные мыши. Этот метод может применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.

Методы для оценки роли c-Fos и Dusp1 в зависимости от онкогена

Этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции мышей рабдомиосаркомы первичных клеток, формирования опухолевой сферы и лечения, и аллотрансплантата трансплантации, начиная с опухолевых культур.

Опухолевая сфера произвлечения и лечения из первичных опухолевых клеток, изолированных от мыши Rhabdomyosarcomas

Внутренне неупорядоченные домены важны для функции фактора транскрипции онкогенного слияния. Чтобы терапевтически нацелиться на эти белки, требуется более подробное понимание регуляторных механизмов, используемых этими доменами. Здесь мы используем транскриптомику для отображения важных структурных особенностей внутренне неупорядоченного домена EWS в саркоме Юинга.

Отображение структурно-функциональных отношений неупорядоченных онкогенных факторов транскрипции с использованием транскриптомного анализа

Этот экспериментальный протокол обеспечивает стабильный, экономичный и эффективный метод, сочетающий уничтожение LncRNA с анализами на формирование колоний для количественной оценки влияния lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы.

Анализ формирования колоний для выявления пролиферативной способности клеток остеосаркомы, вызванных LncRNA-knockdown

Изучите анализ фокус-образования для оценки онкогенного потенциала генов с использованием клеток NIH 3T3. Этот метод помогает исследователям выявлять трансформирующую способность генов in vitro.

Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена

Больше видео