Name: 해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 Drosophila 유충의 상상 디스크 해부 및 면역조직화학 기법을 통해 유전자와 단백질의 공간적·시간적 발현 패턴을 형광현미경으로 분석하는 방법을.

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우리는 JPK에게 원래의 가상적인 디스크 해부 절차를 가르치는 도널드 준비와 케빈 모세에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 그림 1B의 성기 디스크와 그림 3 그림 2A, 브랜든 Weasner의 눈 디스크의 보니 Weasner 감사 플라이 얼룩에 대한 블루밍턴 초파리 주식 센터 및 항체 발달 연구 하이 브리 도마 은행. CMS는 건강 (NIH) GCMS 교육 그랜트의 국립 연구소 (T32-GM007757), 프랭크 W. 퍼트 냄 연구 활동, 그리고 로버트 브릭스 연구 활동에서 장학금으로 지원하고있다. JPK는 국립 안과 연구소의 연구비 지원 (R01 EY014863)

애벌레의 1 준비 <ol><li> 해부 버퍼 35mm 페트리 접시를 채 웁니다. </li><li> 페트리 접시에 유충을 배치하고 몇 분 (자동 세척 단계) 주위에 수영을 할 수 있습니다. </li><li> 실리콘 기반의 해부 접시에 해부 버퍼 풀에 유충을 전송합니다. 이 풀은 판의 한 가장자리에 있어야합니다. 해부 판 유리 페트리 접시 내에 부어 경화 된 실리콘 용액 이루어져있다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여-, 박리 판의 중간에 박리 완충액 큰 풀을 배치. </li><li> # 5 집게를 사용하여 절개 버퍼의 큰 풀에 작은 수영장에서 단일 청소 유충을 전송합니다. </li></ol> 유충의 2 거친 해부 <ol><li> 유충은 해부 버퍼의 대형 수영장 내에있는 동안 집게로 유충을 걸쇠. 포셉의 다른 쌍 ANIM을 보유하는 데 사용되는 동안 집게 한 쌍의 입 후크를 잡기 위해 사용되어야한다알은 여전히​​ (3 분의 몸 길이의 부드럽게 유충을 잡아). </li><li> 신속 포셉 번째 쌍 얻어 신체의 나머지 부분을 당기는 동안 입 후크 근처 표피를 함유하는 핀셋의 쌍을 고정하거나. </li><li> 유충이 뿔뿔이하기 시작하면 당신은 긴장에 약간의 방출을 느낄 것이다. 포셉에서 유충을 해제하고 밖으로 유출하는 유충의 &quot;용기&quot;를 할 수 있습니다. 이것은 정상적인 형태를 유지하기 위해 가상적인 디스크의 수 및 변형되는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 겸자 일쌍 제자리에 유충의 전방 단부를 유지하도록 다시 입 후크 파악. 사용 포셉의 다른 쌍은 내부 용기를 포함하여 유충의 2/3 하부를 제거합니다. 참고 : 입 후크, 눈 더듬이 디스크, 뇌 반구, 복부 신경절, 침샘, 일부 다리 디스크를 포함하는 복잡하고, 위에있는 표피가 유지됩니다. </li><li> 집게의 쌍으로 부드럽게 상부 표피, 침샘, 다리 디스크 및 제거다른 조직. 참고 : 입 후크, 눈 더듬이 디스크, 뇌 반구입니다 남아 있어야 조직 및 복부 신경절 (그림 3). </li><li> 반복은 15 ~ 20 분 동안 추가 애벌레 2.1-2.5 단계를 반복합니다. 주 : 오랜 기간 동안 해부 버퍼 내에 남아있는 가상적인 디스크 성능이 저하하는 경향이 궁극적으로 촬영되는 이상적인 표본 이하로 나타납니다. 따라서, 모든 해부 조직을 고정액 PLP로 전송해야 20 분 후 최대 (아래 참조). </li></ol> 항체와 3 고정 및 조직의 염색 <ol><li> P-200 pipetman을 사용하여, 냉간 파라 포름 알데히드-리신-요오 (PLP)를 포함하는 정착액 시계 접시로 해부 조직을 전송. 50 μL로 전송 해부 버퍼의 제한 볼륨은 PLP의 희석을 최소화합니다. 팁 개방 해부 조직을 수용 할 수있을만큼 큰 수 있도록 면도날과 팁을 끊어야합니다. 집게의 쌍을 사용하거나텅스텐 바늘 해부 조직이 완전히 적절한 고정이 발생하기 위해서는 침수되어 있는지 확인합니다. 45 분 동안 차가운 PLP의 정착액의 해부 조직을 품어. 이 배양 교반하지 않고 실온에서 일어날 수있다. </li><li> P-200의 pipetman를 사용하여 45 분 동안 다른 잘라 노란색 팁을 사용하여 버퍼를 씻어 (RT)를 해부하는 조직을 전송합니다. 50 μL로 전송 PLP의 제한 볼륨은 세척 버퍼의 희석을 최소화합니다. 참고 : 모든 해부 조직이 완전히 침수되어야한다. </li><li> 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 해부 조직의 20 ~ 30 세트를 전송합니다. 주 : 눈 더듬이 디스크 착체의 번호가 큰 튜브 내에 결합하는 경우, 상기 튜브의 하단에 조직이 항체에 노출 적절하지 않을 가능성이있다. 최적의 결과를 위해 더 이상 20 ~ 30 눈 더듬이 디스크 단지 하나의 튜브 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다. 해부 조직은 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착됩니다. 따라서, 후속 단계 U를제거하고 세척 버퍼 차단 솔루션 및 항체를 대체 할 pipetman를 SE는. </li><li> 세척 버퍼를 제거하고 차단 솔루션을 100 ㎕로 교체 : 세척 버퍼 10 % 정상 염소 혈청. 10 분 동안 테이블 위에 회전에 부드러운 회전을 RT에서 품어. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 적절하게 10 % 정상 염소 혈청 희석 된 일차 항체를 100 ㎕로 교체합니다. 16 시간 동안 부드러운 회전을 RT에서 품어. </li><li> 일차 항체를 제거하고 세척 버퍼 750 μL로 교체합니다. nutator에 튜브를 넣고 실온에서 10 분 동안 nutate 할 수 있습니다. 참고 : 차 항체 (4 ° C에 저장)를 저장하고 나중에 재사용 할 수 있습니다. 항체를 여러 번 재사용하면 비 특정 바인딩을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 헤드 후, 튜브의 바닥에 침전 세척 완충액을 제거하고 적절 10 % 정상 혈청으로 희석 된 이차 항체 100 ㎕를 추가 할 수있다. 부드러운 회전과 RT에서 품어 2̵일 4 시간. </li><li> 조직에서 차 항체 솔루션을 제거하고 세척 버퍼 500 μL로 교체합니다. 조직 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. </li><li> P-200과 절단 황색 팁을 사용하여, 해부 접시에 배치 된 세척 버퍼의 풀에있는 모든 해부 조직을 옮긴다. 미세 절개의 다음 단계를 진행하는 동안, 조직을 세척 완충액에 배양한다. 이 과잉 차 항체를 제거하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 4 아이 - 더듬이 디스크 단지의 미세 해부 및 슬라이드에 장착 <ol><li> 아래로 향 복합체의 복부 측면과 입 후크에 의해 표피를 걸쇠 집게 한 쌍을 사용합니다. 집게의 두 번째 쌍의 뇌와 눈 디스크 사이의 공간에 (그림 3, 빨간색 화살표)를 두 번째 집게를 폐쇄하고 신속하게 입 고리에서 떨어져 머리를 잡아 당겨 두 뇌 엽 (叶)을 제거합니다. </li><li> 입 후크 지키고 계속하는 동안, 핀치 오프눈 더듬이 디스크 더듬이 부와 입 후크 (도 3, 청색 화살표) 사이의 연결에 최대한 가깝게 조직. 주 : 눈 더듬이 디스크 단지 모든 조직 (그림 1A)이 없어야합니다. 슬라이드에 배치 할 수 있습니다 원하는 원하는 모든 조직을 해부 할 때까지 계속합니다. 이 프로토콜은 날개 haltere, 다리 및 생식기 가상적인 디스크 (도 1b-E)를 격리하도록 구성 될 수있다. </li><li> 티슈 페이퍼의이 작은 조각 (커버 슬립의 사이즈) 약 3를 추가합니다. 떨어져 해부 접시에. 접시 위에 슬라이드 유리를 배치 - 휴지 두 조각의 슬라이드 단부하에 있어야한다. 이 해부 접시의 실리콘베이스에 달라 붙는 슬라이드를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 도련 끝 P-20을 이용하여, 유리 현미경 슬라이드의 중간 항 표백제 9 μL를 추가한다. 형광으로 볼 때 조직의 탈색을 방지빛. </li><li> 같은 포경 팁을 사용하여, 모든 눈 더듬이 디스크를 수집 및 안티 표백 시약의 드롭에 추가합니다. 위에 수행되는 세척 버퍼의 양을 최소화한다. 10 μL 이하로 세척 버퍼의 양을 제한하려고합니다. </li><li> 분리 및 안티 표백 시약의 드롭 내 눈 더듬이 디스크를 확산 집게 한 쌍을 사용합니다. 디스크가 몇 분 동안 반 표백 시약에 부화 할 수 있습니다. 참고 : 조직 반 표백 시약을 흡수으로 디스크가 분명집니다. </li><li> 좋은 붓을 사용하여 부드럽게 시편 상에 커버 슬립을 낮 춥니 다. 이 기포의 형성을 방지한다. </li><li> 스토어 빛 또는 형광 현미경을 사용하여 눈 더듬이 또는 다른, 상상 디스크를 볼 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 슬라이드. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 절차는 크게 분리 눈길 더듬이 디스크의 후속 처리에 초점을 맞추고 있지만, 그것을 분리하고 날개 haltere, 다리 및 생식기 디스크 (도 4)을 분석하는데 사용되는 의무가있다. (눈 더듬이 디스크와는 대조적으로) 이러한 디스크를 분리하는 프로토콜의 유일한 필수 변형 조대 해부 (프로토콜의 섹션 2)의 방법이다. 제 흉추 레그 (T1) 쌍 유충의 앞쪽에서 발견되어 눈길 더듬이 디스크 절연을위한 프로토콜에 따라 회수 할 수있다. 그러나 두번째 가슴 다리 (T2) 디스크는 표피에 부착된다. 집게의 또 다른 한 쌍의 동물의 복부 표피를 걸쇠에 사용하는 동안 위에서 설명한대로 집게 한 쌍의 입 후크를 보유하는 데 사용되어야한다 이러한 디스크를 분리하기 위해 (에서 유충에 대한 3 분의 걸쇠해야합니다 입 후크. 유충은 단순히 LAR의 나머지 부분에서 떨어져 복부 표피를 찢어 필렛 할 수 있습니다버지니아. T2 다리는 표피에 부착 된 상태로 유지됩니다. 셋째 흉추 (T3)는 다리에 부착 된 표피 자체 ...

한 세기 이상 초파리, 초파리의 경우, 개발, 행동과 생리학을 연구하는 최고의 시스템이다. 후자의 촬영 장소의 대부분과 배아 및 사후 배아 단층 상피 내에서 가상적인 디스크 1-3 전화 : 파리의 개발은 크게 두 단계로 나눌 수 있습니다. 가상적인 디스크의 그림은 첫번째 곤충 개발 한 그의 광범위한 논문의 일부가 오는 8 월 Weismann에 의해 1864 년에 출판되었다. 이러한 디스크는 1-14 플라이 성인에서 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기 궁극적으로 조기 번데기 단계 대규모 histolysis 생존하고, 유생 단계 동안 패턴 화되고, 배아 발생 동안 그들의 발전을 시작한다. 애벌레 개발 과정에서 각 디스크의 운명, 모양과 크기에 관한 몇 가지 중요한 결정을합니다. 제 1 및 제 2 령 유충 내 디스크는 일차 운명을 취 establis을 주어 아르정확한 형상을 채용하고 15-16 세포의 필요한 수를 생성 구획 경계 힝. 셋째 애벌레 령 초 전 번데기의 단계에서, 상상 디스크는 계속 분열 및 세포가 자신의 단말기 운명 16을 채택으로 패턴 화되어있다. 초파리 발달 생물학의 초기 역사 동안, 가상적인 디스크는 정상적인 발달의 컨텍스트에서 그리고 손실이나 기능 획득 돌연변이가 생존시킨 제한된 경우에 거의 독점적으로 연구되었다. X 선의 사용은 치명적인 돌연변이 허용 유사 분열 재조합이 유충 및 성인의 조직 내의 세포 클론에서 분석 될 유도. 이 방법은 유충 및 성인 조직 모두에서 돌연변이 손실을 분석하여 기능 획득하는 형질 전환 방법의 도입에 의해 개선되었다. 야생형 및 돌연변이 분자의 조직을 설명하기위한 프리 항체, 전사 리포터 단백질 트랩 번호도이다 CONSTantly 성장. 돌연변이 세포 클론을 손실을 분석하여 기능 획득하기 위해 이들 분자 표지 사용은 점점 실현 돌연변이 세포를 개발하는 동안 그들의 야생형 사촌 이탈 방법의 실시간 이해하도록했다. 적절 이러한 도구 및 시약을 이용하려면 그것은, 볼 촬영하고 분석 할 수 디스크의 가상적인 고품질 제제를하는 것이 중요하다. 이 원고의 목적은 눈 더듬이 디스크 착체 (도 1a)의 분리 및 제조를위한 최적의 프로토콜을 제공하는 것이다. 또한 성공적 날개 halteres, T1-T3의 다리와 성기 (도 1b-E)을 야기 된 것을 포함하여 부가적인 디스크의 다양한 분리하는데 사용될 수있다. 약간의 수정이 절차는 거의 팔십년에 초파리에서, 상상 디스크를 분리하기 위해 사용되어왔다. 대부분의 유전자 뮤 중에 발현되므로 같이, 상술개발 및 조직의 다양한 단계에서 ltiple, 그것은 동물 셋째 령 유충 단계 전에 잘 죽으면 널 돌연변이가 전체 눈에 미치는 영향을 연구하는 것이 불가능하다. 네 방법은 훨씬 더 다루기 쉬운 망막으로 더 많은 개발 조직의 연구를 만들었습니다. 첫째는 달리 야생형 조직 내에 17-19 돌연변이 세포 클론을 생성 Flippase (FLP) / Flippase 재조합 타겟 (FRT) 방법이다. 이때 돌연변이 조직은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 시각적 마커의 부재에 의해 식별되며, GFP가 존재하는 야생형 주변 조직 (도 2D)에 비교 될 수있다. 두번째 유전자는 셀 (20)의 집단에서 발현되는 &quot;FLP 아웃&quot;방법이다. 이 경우 세포 클론은 GFP 기자 부족 주변 야생 형 조직 (그림에 GFP의 존재에 의해 확인 및 비교2E). 세 번째는 FLP / FRT 돌연변이 복제 및 FLP 아웃 발현 시스템 (21)의 요소를 결합 Repressible 세포 마커 (MARCM) 기법과 모자이크 분석이다. 이 방법은 유전자를 동시에 개별적 유전자 유전자좌위한 돌연변이이다 세포 집단 내에서 표현 될 수있다. FLP 아웃 클론 마찬가지로 MARCM 클론 GFP의 존재에 의해 식별되고 GFP 마커 (도 2F)를 결여 주변 야생형 조직과 비교된다. 그리고 마지막으로, 유전자의 RNAi 구성체는 특정 프로모터 GAL4 구조의 제어에 가상적인 조직 내에서 발현 될 수있다. 돌연변이 또는 과발현 클론 또는 패턴이 직접 인접 야생형 조직과 비교 될 수 있기 때문에 이러한 네 가지 방법은 가상적인 디스크를 연구에 관심이 증가하고있다. 이 절차에 설명 된 방법이 개발되어 있기 때문에 초파리에서 성인 조직 후 배아 발달을 연구 연구자특히 눈 더듬이 디스크에서 유래 된이 분석을 위해 고품질의 조직을 얻을 수있을 것입니다. 개별 연구자가 약간의 수정을 만들었습니다 있지만,이 절차 (우리는 여기에 설명되는)의 핵심은 크게 변경되지 않은 채 남아있다. 높은 품질의 조직을 얻는 것은 우리가이 기록 된 프로토콜과 첨부 된 동영상이 귀중한 교육 자원이 될 것입니다 희망, 상상 디스크의 연구에 매우 중요하기 때문에.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 KG</td><td>해부 플레이트의 기초를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>해부 플레이트</td></tr> <tr><td># 5 해부 집게</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>집게는 매우 날카롭게 유지해야합니다</td></tr><tr><td>9 잘 시계 유리</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>상상 디스크 복합체의 고정에 사용</td></tr><tr><td>: 50 ml Erlenmeyer 플라스크</td><td>, 다양한 공급 업체,</td> 다양한 공급 <td></td><td>업체</td></tr>, <tr><td></td><td>삼각 플라스크에 들어갈 수있을만큼 작음</td><td></td> 50 ml 원뿔형 튜브, 다양한 공급 업체 1.5 ml 마이크로 배식 튜브, 다양한 공급 업체, 용도에 따라 투명 또는 어둡게, 마이크로 배식 랙 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 로테이터</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td>100 &# 956; l 부피는 낮은 설정에서 튀지 않아야합니다</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>고정액 역할</td></tr>을합니다 인<tr><td>산 나트륨 Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>해부 및 세척 버퍼를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>해부 및 세척 버퍼를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>고정액</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td>에 <td>사용 고정액</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>가상 디스크 천공에 사용</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>파라 포름 알데히드</td></tr><tr><td>100 % 일반 염소 혈청</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>을 용해하는 데 사용차단 용액으로 작용</td></tr><tr><td>1차 항체</td><td>다양한 공급업체</td><td></td><td>는 제조업체의 지시에 따라 10% 염소 혈청으로 희석</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>다양한 공급업체</td><td></td><td>는 제조업체의 지시에 따라 10% 염소 혈청으로 희석</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molecular Probes</td><td>H-1000</td><td>샘플의 표백 방지</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe 티슈</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td>유리 슬라이드가 실리콘베이스에 부착되는 것을 방지</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>다양한 공급 업체</td><td></td><td>샘플에 커버 슬립을 부드럽게 내리는 데 사용합니다</td></tr></tbody></table>.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

후 배아 초파리에서 개발, 초파리의 중요한 부분은 가상적인 디스크라고 불리는 주머니 같은 구조의 집합 내에서 일어난다. 이러한 디스크는 성인 플라이 내에 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기. 여기에서 우리는이 디스크를 복구하고 항체, 전사 기자 단백질 트랩과 분석을 준비하기 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 가장 가상적인 디스크 등 얇은 조직에 적합하지만, 용이하게 애벌레 및 성인 뇌 난소 조직과 같이 두꺼운 용도 변경 될 수있다. 서면 프로토콜과 함께 제공되는 동영상은 세번째 령 유충, 조직의 고정 및 항체, 상상 디스크 치료의 절개를 통해 독자 / 시청자를 안내합니다. 프로토콜은 또한 이하의 제 1 및 제 2 령 유충으로부터 가상적인 디스크를 해부하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 장점은 상대적으로 짧은 것을이며 수있다해부 조직의 높은 품질의 보존을 위해 최적화 도중에. 또 다른 장점은 사용되는 고정 절차가 초파리 단백질을 인식하는 항체의 압도적 인 숫자로 잘 작동한다는 것입니다. 우리의 경험에 의하면,이 절차를 잘 작동하지 않는 민감한 항체의 매우 작은 수는있다. 이러한 상황에서, 치료는 우리가 해부 단계와 항체 배양을 위해 규정 한 가이드 라인을 따라 계속하는 동안 다른 고정 칵테일을 사용하는 것으로 나타납니다.

확실히 상술 된 방법은 인 시츄 프로브, 전사 리포터 단백질 트랩과 함께 항체의 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성한다. 그림 1에서 우리는 정기적으로이 방법으로 회수 눈 안테나, 생식기, 날개, haltere과 다리 디스크를 표시합니다. 이러한 디스크는 F-액틴에 결합하기 때문에 각각의 셀을 설명 phalloidin - 복합 형광 물질로 처리되어있다. 조직은 다음 제대로 눈 디스크의 형태 형성 고랑 고정 된 경우, 동심 조직의 가장자리는 생식기, 더듬이와 다리 디스크에 주름 및 날개와 haltere 디스크의 지느러미 - 복부 축이 모두 같은 날카로운 모서리를 나타납니다 . 조직이 제대로하고 고정되어있는 경우 항체, 형광 단백질과 현장 프로브에 또한 날카로운 패턴을 발표 할 예정이다. 몇 가지 예는 그림 2에 나타내었다. 동안 다른 항체로 염색 한 상위 3 패널 디스플레이 디스크를아래 세 개의 패널은 GFP는 세포의 인...

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 유충에서 상상의 디스크를 해부하는 것입니다.면역조직화학을 위해 먼저 유충에서 입, 갈고리, 눈, 1열 디스크로 구성된 머리 복합체와 뇌를 제거하여 이를 수행합니다. 두 번째 단계는 머리 복합체를 고정하고 1차 및 2차 항체로 배양하는 것입니다. 다음으로, 눈과 1개 디스크를 두부 복합체에서 분리합니다.마지막 단계는 유리 슬라이드에 표백 방지제에 담긴 상상의 디스크를 장착하는 것입니다. 궁극적으로 형광 또는 LAC Z 리포터 및 항체 염색은 형광 현미경을 사용하여 상상 조직 내 유전자 및 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 enten imaginal disc에서 유전자 및 단백질 국소화에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.또한 날개, 다리 및 정지와 같은 다른 상상 조직에 적용할 수 있습니다. 여기. 실험을 시작하려면 35mm 페트리 접시에 해부 버퍼를 채웁니다. 페트리 접시에 10-20마리의 유충을 넣고 5분 동안 헤엄치게 합니다.해충을 자가 청소하기 위해 피펫은 실리콘 기반 박리 플레이트의 중간에 하나의 큰 해부 버퍼 풀을 만듭니다. 큰 웅덩이 주위에 세 개의 작은 웅덩이를 놓고 집게를 사용하여 유충을 아래쪽 웅덩이로 옮깁니다. 다음으로, 5번 집게를 사용하여 작은 웅덩이에서 한 마리의 청소된 유충을 해부 완충액의 더 큰 웅덩이로 옮깁니다.거친 해부를 시작하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 유충을 부드럽게 잡습니다. 몸 길이의 3분의 1은 입 갈고리를 안정적으로 유지합니다. 두 번째 집게로 몸의 나머지 부분을 빠르게 당겨 빼냅니다.집게에서 유충을 풀어주고 내장이 쏟아져 나오도록 하여 상상의 원반이 정상적인 확인 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 입 고리를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 내부 내장을 포함하여 유충의 아래쪽 2/3를 제거합니다. 그런 다음 침샘, 다리 디스크 및 기타 조직을 부드럽게 제거합니다.유일하게 남아야 하는 조직은 위에 있는 소량의 큐티클입니다. 입 고리, 눈 및 건추 디스크, 뇌 반구, 복부 신경절. 최대 20분 후, 절개된 모든 조직을 파라폼 알데히드 라이신 파리아로 옮깁니다.날짜 고정제 또는 PLP. 가상 디스크를 해부 버퍼에 20분 이상 두지 마십시오. 그렇지 않으면 해부 후 성능이 저하됩니다. 절개된 조직을 100마이크로리터 단위로 차가운 PLP가 들어 있는 시계 유리로 옮깁니다.한 쌍의 집게를 사용하여 절개된 조직이 완전히 잠겼는지 확인합니다. 절개된 조직을 저온 PLP 고정액으로 교반 없이 실온에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로, PLP에서 100마이크로리터의 절개된 조직을 세척 버퍼로 옮깁니다.조직이 완전히 잠겼는지 확인하고 45분 동안 흔들지 않고 실온에서 배양합니다. 그런 다음 절개된 조직을 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 세척 버퍼를 제거하고 100마이크로리터의 차단 용액으로 교체하십시오.실온에서 탁상용 로테이터에서 10분 동안 부드럽게 회전시키며 조직을 배양합니다. 차단 후 용액을 제거하고 10% 정상 염소 혈청에 100마이크로리터의 1차 항체 용액으로 교체합니다. 항체의 강도에 따라 16시간 동안 부드럽게 회전하면서 실온에서 조직을 배양합니다.다음으로, 1차 항체를 제거하고 750마이크로리터의 세척 버퍼로 교체합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 돌연변이원에 놓습니다. 돌연변이체에서 튜브를 제거하고 헤드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.그런 다음 세척 버퍼를 제거하고 100% 일반 혈청에 100마이크로리터의 2차 항체 용액을 추가합니다. 항체의 강도에 따라 최소 2시간 동안 부드럽게 회전하면서 실온에서 튜브를 배양합니다. 배양 후 조직에서 2차 항체 용액을 제거합니다.500마이크로리터의 세척 버퍼로 교체하고 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 실리콘 해부 플레이트에 세척 완충액 3개를 놓습니다. 해부된 모든 조직을 해부 접시에 놓인 큰 세척 완충액 풀로 옮깁니다.이것은 과도한 2차 항체를 제거하여 미세 해부를 시작하고, 머리 복합체를 복부 쪽이 아래로 향하게 배치하고, 입 고리로 큐티클을 잡는 데 도움이 됩니다. 뇌와 안구 디스크 사이의 공간에 두 번째 집게를 놓고 입 고리를 계속 유지하면서 두 개의 뇌엽을 제거하기 위해 입 고리에서 뇌를 빠르게 당겨 빼냅니다. 눈 안테나 디스크의 안테나 부분과 입 고리 사이의 연결에 최대한 가깝게 조직을 집어 제거합니다.원하는 모든 조직이 절개될 때까지 계속합니다. 다음으로, 해부 접시에 커버 슬립 크기의 작은 티슈 페이퍼 두 개를 3인치 간격으로 추가합니다. 슬라이드가 해부 접시의 실리콘 바닥에 달라붙는 것을 방지하기 위해 이 종이 조각에 유리 슬라이드를 놓습니다.P 20 피펫 맨을 사용하여 유리 현미경 슬라이드의 중간에 9 마이크로 리터의 표백제를 첨가하여 동일한 자르지 않은 팁으로 조직의 형광등 표백을 방지하고 모든 I 및 tenal 디스크를 모아 표백 방지 시약의 방울에 추가합니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 가상 디스크가 닿지 않을 때까지 표백 방지 시약을 한 방울 떨어뜨려 눈과 테널 디스크를 분리하고 펼칩니다. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 기포 형성을 방지하기 위해 표백 방지제 방울에 커버 슬립을 부드럽게 내립니다.마지막으로, 광이나 형광 현미경을 사용하여 이온 텐널 디스크를 보고 이미지화할 준비가 될 때까지 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 이 방법은 상상 디스크의 이러한 컨포칼 이미지가 전달하는 분석을 위한 고품질 자료를 안정적으로 생성합니다. 디스크는 foid와 jugated fluoro four로 치료되었는데, 이는 f actin에 결합하여 각 세포의 윤곽을 그립니다.이빨 추간판의 가장 두드러진 특징 중 하나는 형태발생학적 고랑(morphogenetic furrow)으로, 이는 등쪽 배쪽 축을 따라 달리는 조직 내의 움푹 들어간 곳으로 볼 수 있습니다. 고랑이 안구를 가로질러 진행됨에 따라 무질서한 세포의 바다는 주기적으로 간격을 둔 단위 눈 또는 오마 테디아(Oma Tedia)의 질서 정연한 배열로 변형됩니다. 클론 발현의 검증 및 I 상상 디스크의 분석은 이 방법의 다운스트림 응용이 가능합니다.상단 3개의 패널에는 ilis, A DPP, LAC Z 전사 리포터와 같은 다양한 항체와 배아, 치명적, 비정상 시력 또는 범 신경 세포, RNA 결합 단백질을 암호화하는 vy와 같은 세포 특이적 마커로 염색된 디스크가 표시됩니다. 아래쪽 3개의 패널은 GFP가 세포 집단을 표시하는 데 사용되는 디스크를 보여줍니다. 이 과정을 마스터하면 10-20마리의 유충에서 머리 복합체를 분리하는 데 약 10분이 소요되며, 추가로 이러한 복합체에서 이온 텐널 디스크를 미세하게 분리하는 데도 약 10분이 소요됩니다.

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 3 instar 단계에서 drosophila의 유충에서 imaginal 디스크를 분리에 사용되는 절개 기법을 보여줍니다. 말하는 후 조직을 고정하고 날개, 다리와 눈 디스크를 제거하는 방법은 직접 이후 시각화를위한 현미경 슬라이드에 시연하고 있습니다.

셋째 Instar Drosophila의 유충에서 Imaginal 디스크의 해부

우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를...

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

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애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

초파리 상상 디스크를 염색할 때, 디스크가 노출되어 있지만 몸에 붙어 있는 부분을 거칠게 해부하는 경우가 많습니다. 염색이 완료되면 관심 디스크가 분리되어 장착됩니다. 예제 프로토콜은 날개 상상 디스크 해부 및 장착 절차를 보여줍니다.

초파리 유충 상상 디스크 해부: 상피 발달을 관찰하는 방법

이 기술의 목표는 연구자들이 모든 연령의 Drosophila melanogaster에서 번데기 안구 디스크의 해부, 면역 염색 및 장착을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.

해부와의 설치<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 아이 디스크

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

우리는 GFP 재구성 기반 접근법을 사용하여 살아있는 초파리 날개 상상 디스크의 인접한 상피층에 있는 세포 간의 접촉을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤군에 의해 매개되는 세포-세포 접촉을 평가하기 위한 GFP 상보 기반 이중 발현 시스템

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

학습하세요 Drosophila 유충의 상상 디스크 해부 및 면역조직화학 기법을 통해 유전자와 단백질의 공간적·시간적 발현 패턴을 형광현미경으로 분석하는 방법을.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

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