جيل المعدلة وراثيا حيدرة من جانب الأجنة حقن مكروي

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن الحمض النووي للبلازما في أجنة الهيدرا لإنتاج خطوط معدلة وراثيا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير محلول الحمض النووي للبلازما أولا وتحميله في إبرة الحقن. بعد ذلك ، يتم حقن محلول الحمض النووي للبلازما في أجنة هيدرا بين مرحلتي الخلية الواحدة والثامانية.

ثم يسمح لأجنة الهيدرا بالتطور والفقس ويتم اختيار الأحداث ذات الأنسجة المعدلة وراثيا. الخطوة الأخيرة هي إنتاج خط معدل وراثيا موحد عن طريق التبرعم اللاجنسي للحيوان المعدل وراثيا الأصلي. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لتصور التعبير المعدل وراثيا في الهيدرا.

تم تصميم هذه الطريقة للباحثين الذين يرغبون في صنع خطوط مائية معدلة وراثيا بتكلفة منخفضة ، مما يسمح بتطبيق أوسع لهذه التكنولوجيا المفيدة ، سواء للباحثين المائي الحاليين ، أو أيضا لأولئك الذين يرغبون فقط في البدء في استخدام هذا النموذج. تستخدم الهيدرا المعدلة وراثيا لدراسة ديناميكيات الأنسجة ، ووظيفة جين توطين البروتين عن طريق الضربة القاضية والإفراط في التعبير ، وكذلك وظيفة المروج. بعد تحضير الحمض النووي للبلازما وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد طبق حقن عن طريق وضع مجهر زجاجي 75 × 50 أولا.

انزلق في طبق بتري مقاس 100 × 15 ملم بزاوية تذوب 2٪ agros في 50 مل من وسائط hydra. دعها تبرد. ثم اسكبه في طبق بتري بعد أن تصلب الأغروس ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية وباستخدام شفرة الحلاقة ، قم بقطع أي أغروة زائدة لتشكيل جدار.

ثم صب وسط الهيدرا على الفور في الطبق واستخدمه على الفور أو قم بتخزينه على أربع درجات مئوية لحين الحاجة. لتحضير محلول الحقن ، امزج ثلاثة ميكرولتر من 2.5 ملليغرام لكل مليلتر من محلول الحمض النووي للبلازما مع ميكرولترين من محلول أحمر الفينول بنسبة 10٪. قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة ثم قم بتدويره لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق لإزالة أي جزيئات قد تسد الإبرة تحت مجهر تشريح.

استخدم الملقط لقص الإبرة على بعد بضعة ملليمترات من الحافة لإنشاء فتحة صغيرة. قم بتوجيه طبق بتري الذي يحتوي على الإبرة بحيث تكون الإبرة في وضع رأسي مع الحافة لأسفل. ثم ضع الماصة حوالي 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن في الطرف الخلفي للإبرة.

لتحضير الأجنة للحقن ، ابدأ بمسح هيدرا ، وهي ثقافة سلالة EP للأورام الحميدة المنتجة للبيض. اجمع هذه الاورام الحميدة وانقلها إلى طبق ثقافة منفصل. راقب هذه الاورام الحميدة كل بضع ساعات خلال اليوم لمراقبة تقدم تكوين البيض.

عندما يخترق البيض الأديم الظاهر ويجلس على حلقة من الخلايا الجلدية المتراجعة ، يكون جاهزا للحقن ضع الاورام الحميدة التي تحتوي على بويضات جاهزة للحقن في طبق به العديد من الهيدرا التي تحتوي على خصيتين لمدة ساعة على الأقل قبل الحقن للسماح بالتخصيب إذا تم العثور على الإناث في مستعمرة EP مع بويضات كاملة التكوين أو أجنة من واحد إلى ثماني خلية. اجمعها أيضا للحقن قبل الحقن. استخدم مشرطا بشفرة رقم 15 لإزالة معظم الأنسجة الأبوية أعلى وأسفل الأجنة التي بدأت في الانقسام ، تاركة لها قطعة صغيرة فقط من عمود جسم الوالدين.

احتفظ بالأنسجة المقطوعة في وسط هيدرا لأنها ستتجدد وتضمن بقاء الإناث في مستعمرة هيدرا. استخدم ماصة المراعي لنقل الأجنة المتشققة إلى طبق الحقن ، وترتيبها بالتوازي مع جدار حوض الزرع. لتحضير الحاقن الصغير المثبت على حامل مغناطيسي يجلس على صفيحة حديدية.

قم بتركيب حامل الحقن ، وهو جزء من الحاقن الصغير الذي يحمل الإبرة على مناور ميكروم عصا التحكم. باستخدام حامل مغناطيسي ، قم بتركيب مناور عصا التحكم على الصفيحة الحديدية. ثم ضع الإعداد بالكامل على الجانب الأيمن من مجهر التشريح وضع حامل الحقن بحيث يكون مرئيا في مجال المراقبة.

ضع طبق الحقن مع الأجنة تحت مجهر التشريح الموجه بحيث يكون الجدار الرأسي للحوض الصغير على اليسار. أدخل الإبرة في حامل الحقن وقم بخفض طرف الإبرة في وسط الهيدرا في الطبق. بعد ذلك ، أدر مقبض المحقنة ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى يملأ الزيت المعدني الجزء العلوي من الإبرة ويلاحظ تدفق مستمر من محلول الحقن يخرج من الإبرة إلى وسط هيدرا.

إذا كان التيار قويا جدا ، فقم بخفض الضغط عن طريق تدوير المقبض عكس اتجاه عقارب الساعة. قم بتوسيط الجنين في مجال الرؤية ، وحرك الإبرة بحيث تلامس الجنين. ثم استخدم مناور الميكروم لثقب الجنين بالإبرة والسماح لمحلول الحقن بالتدفق إلى الجنين لمدة ثانية أو ثانيتين قبل إزالة الإبرة بسرعة.

إذا كان الجنين يحتوي على أكثر من خلية واحدة ، فقم بحقن كل خلية على حدة. استمر حتى يتم حقن جميع الأجنة. بمجرد حقن جميع الأجنة ، انقلها إلى طبق به عدد قليل من Hydra ، وهي سلائل EP لها خصيتان واحتضانها عند 18 درجة مئوية بينما تستمر في الخضوع للتطور الجنيني.

عندما تصل الأجنة إلى مرحلة البشرة ، انقل كل جنين إلى بئر من 24 صفيحة بئر مملوءة بوسط هيدرا ، واحتضن لمدة أسبوعين في الظلام عند 18 درجة مئوية. ثم تحت مجهر تشريح ، افحص كل جنين بحثا عن انفصال القطعة الصغيرة من الأنسجة الأبوية وتجديد هذا الأنسجة. إذا كان موجودا ، فقم بإزالته على الفور حتى لا يتم الخلط بينه وبين الفقس الجديد.

بعد فحص كل جنين ، حرك الطبق تحت ضوء حوض السمك في درجة حرارة الغرفة. افحص الأطباق كل يوم واجمع الصغار. سيكون الفقس الجديد أبيض اللون لأنهم لم يأكلوا بعد.

راقبهم تحت المجهر الفلوري للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا. استخدم آرت نابولي لإطعام الصغار المعدلة وراثيا كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما تنتج الفقس المعدلة وراثيا في الأنسجة الظهارية الكهربية أو الأديم الباطن براعم ، يتم تقييمها للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا.

يظهر هنا فقس مع تعبير خيميري لأحمر Ds ، واثنين من الجينات المعدلة وراثيا تحت سيطرة محفز الأكتين ورقعة من الخلايا الظهارية للأديم الظاهر. يمكن أن ينتج عن التبرعم المستمر للحيوان في النهاية خطا بتعبير موحد عن الجين المعدل في السلالة الظهارية الكهربية أو الأديم الباطن. كما هو موضح هنا ، ينتج الفقس الأصلي الآن برعمين جديدين.

البرعم المسمى بعلامة النجمة ، لا يحتوي على نسيج معدل وراثيا وتم استخدامه كحيوان مؤسس لخط تحكم مطابق وراثيا للخط المعدل وراثيا باستثناء وجود الجينات المعدلة وراثيا. هذا هو أول برعم به أنسجة معدلة وراثيا يتم إنتاجها من الفقس الأصلي. من خلال هذه التجارب باستخدام الجينات المعدلة وراثيا التي ليس لها تأثير على الوظيفة البيولوجية ، تم إنشاء خطوط خلايا ظهارية موحدة من حوالي 30٪ من الهيدرا التي تفقس مع الأنسجة المعدلة وراثيا الظهارية.

يتم إنشاء خط الجلد الكهربائي الموحد كما هو موضح هنا بنسبة 33 إلى 50٪ أقل من خط الأديم الباطن. لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع خطوط مائية معدلة وراثيا ، والتي ستضيف إلى ذخيرة الدراسات الوظيفية التي يمكنك القيام بها باستخدام هذا النموذج.