Name: 소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 인간 전혈과 내피 세포 상호작용을 연구하는 새로운 시험관 모델을 활용한 혈관생물학 기법입니다. 이 방법은 혈전-항혈전 복합체 형성과 면역 반응을 분석하여 혈관 질환 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 N 602699 (DIREKT) ​​° 부여 계약에 따라 스웨덴 연구 협의회 (90293501, A0290401, A0290402), 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다, NovoNordisk 재단, Gurli 에드워드 Brunnberg 재단, 치료, Vleugel 줄기 재단과 아케 WIBERG 재단.

참고 : 혈액 웁살라 윤리 심의위원회 (허가 번호 264분의 2,008)와 승인의 개방형 시스템 정맥 천자에 의한 건강한 사람에서 도출되었다. 1. 시드 세포 <ol><li> T75 플라스크 중 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 차 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 PBS (pH 7.4) 중 1 % 젤라틴으로 코팅. </li><li> T75의 HUVEC을 포함하는 플라스크 (또는 기본 인간의 내피 세포의 다른 유형)에서 배지를 제거하고 PBS의 pH를 7.4에서 2.1 mM의 EDTA로 세포를 씻으십시오. 37 ° C에서 3 분 - 1 ml의 0.25 % 트립신 EDTA를 추가하고 2 배양하여 세포를 분리합니다. </li><li> PBS pH를 7.4에서 9 ml의 10 % FBS로 플라스크를 세척하여 세포를 수집하고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 5 분 동안 735 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 상등액을 제거하고 내피 세포 성장 배지 미세 혈관 (EC GMMV) 신중 세포 펠렛을 재현 탁하고 Bürker 챔버에서 세포를 카운트. 21,000 C 종자ELL 학생 / 1 웰 세포 배양 슬라이드에 cm 2, 37 ° C에서 품어. 문화 2 일 - HUVEC은 1 일 이후에 컨 플루 언트됩니다. 가벼운 현미경으로 세포 형태와 컨 플루 매일을 모니터링합니다. </li></ol> 전혈 2. 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 고정 된 헤파린 (CHS)의 더블 레이어 혈액과 접촉하는 모든 인공 표면을 준비합니다. 먼지로부터 보호 CHS 코팅 재료는 기능의 손실없이 최대 6 개월 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 혈액 내피 챔버 실험을 시작하기 전에 곧 건강한 기증자 (&lt;30 분)에서 혈액을 채취하는 개방형 시스템 정맥 천자를 사용합니다. 조심스럽게 CHS 코팅 된 50 ㎖ 튜브에 혈액을 수집하기 전에 : (2mm 내경) 커플은 피하 주사 바늘 CHS 코팅 실리콘 튜브로 (18 G는 50mm를 X). 미분 획 헤파린 보충 혈액 0.75 IU / ml의 최종 농도에 도달한다. INVE에 의해 부드럽게 혈액을 혼합3 회 - 튜브 2를 rting. </li></ol> 3. 혈액 내피 상공 회의소 모델 <ol><li> PMMA 슬라이드 (25 X 75mm)에 붙어 두 개의 실린더 (높이 8mm 및 반경 9mm)로 구성된 아크릴 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA)에서, 혈액 챔버 (상위 뷰 그림 1A)를 제작합니다. 배양 된 내피 세포 (도 1b)를 가진 유리 슬라이드에 대해 혈액 챔버를 밀봉하기 위해 고무 O 링이 위쪽으로 향하도록 실린더의 가장자리를 장착한다. 그 후 수직 위치 (그림 1C)에서 내피 세포와 배양 슬라이드에 연결된 혈액 챔버를 회전합니다. </li><li> 혈액을 활성화하지 챔버 돌보는 코팅 각 CHS에 1.5 ml의 혈액을 전송하는 CHS 코팅 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> MK에게 μL 0.34 3 30 EDTA를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브로 이동 1 ml의 혈액을 사용하여 초기 혈장 단백질 농도 측정을 위해 10 mM의 K 3 EDTA의 최종 농도에 도달효소 면역 분석법 (ELISA)를 연결. 조심스럽게 피를 혼합하고 얼음에 튜브를 유지. </li><li> PBS pH를 7.4에서 세포를 씻어 신중 제조업체의 지시에 따라 세포 배양 유리 슬라이드의 플라스틱 벽을 제거하고. 이후 슬라이드에서 가능한 한 많은 액체를 제거해야합니다. 세포가 건조하게하지 마십시오. </li><li> 혈액에 직면 세포, 혈액 챔버의 상단에 슬라이드를 놓습니다. 혈액 내피 세포 챔버 주위에 클램프를 배치하여 슬라이드를 고정. 클램프를 배치 할 때 세포 배양 유리 슬라이드의 파손을 방지하기위한 추가 지원 플라스틱 슬라이드를 사용한다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 회전 바퀴에 혈액 내피 세포 챔버를 수정 (40 직경 CM) 장소. 30 분 동안 0.5 XG에서 바퀴의 각 실을 돌립니다. </li><li> 배양 후, 혈액 내피 세포 챔버 해체. F PBS의 pH를 7.4에서 세포 배양 슬라이드를 세척하고 (PFA)를 얼음 차가운 1 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정또는 10 분. μL 0.34 MK 3 EDTA를 (30)를 포함하는 마이크로 원심 튜브에 각각의 챔버에서 전송 1 ml의 혈액을 10 mM의 K 3 EDTA의 최종 농도에 도달하고 부드럽게 튜브를 혼합합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 4,560 XG에서 튜브를 원심 분리기. 추가 분석 할 때까지 -70 ℃에서 새로운 마이크로 원심 튜브 및 저장소에 혈장을 전송합니다. </li></ol> 혈액 내피 세포의 상호 작용 4. 분석 <ol><li> 보조 염소 항 - 마우스 알렉사 488과 팔로이 딘 - TexasRed 다음 마우스 항 - 인간 CD16과 면역 형광 염색을 수행합니다. 실온에서 1 시간 동안 각 염색 공정을 수행하고, 각 단계 사이에 PBS pH를 7.4에서 슬라이드를 세척 하였다. 실온에서 10 분 동안 DAPI로 핵 Counterstain과. 이미지 분석은 CellProfiler 같은 적당한 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 조합하여 형광 현미경으로 혈관 내피 세포에 결합 된 혈액 성분을 분석한다. </li><li> 정량화회계 연도 혈장의 제조 업체의 지침에 따라 트롬빈 - 안티 트롬빈 (TAT) ELISA와 혈액 구획의 반응. </li><li> 적절한 통계 도구, 예를 사용한다., 짝 t 테스트를, 데이터를 분석. </li></ol>

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</ol>

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<html> 혈액 및 혈관 벽 사이의 다중의 상호 작용은 일반적 의한 내피 세포의 비 - 접착 성 및 항 혈전 특성으로 정지 상태로 유지된다. (7) 염증과 관련된 병리 적 상태 동안, 내피 세포 부착 수용체 발현 8에서 얻어진 증가 활성화되고 감소 된 능력을 억제하는 지혈. 차례의 혈액에서 캐스케이드 시스템 (9) 활성화가 더 혈전증 및 백혈구 모집의 원인이되는 혈관 내피 세포의 혈전을 증폭시킨다. (10) 내피 세포 및 전체 혈액 사이의 미묘한 상호 작용에 대한 이해를 얻으려면, 우리가 배양 된 내피 세포는 전체 혈액과 접촉에 배치됩니다 체외 방법에 소설을 개발했다. 우리가 알기로는, 우리의 설치는 더 이상 기간에 대한 아니오 전체 인간의 혈액 또는 약간의 항응고제로 배양 내피 세포를 보여 처음이다. NT &quot;&gt;이 시스템의 감도는 혈액과 접촉에 배치 모든 표면에 고정화 된 헤파린의 보호 층과 함께 개방형 시스템 정맥 천자로 사용할 수 있습니다. 혈액 조달 동안 개방형 시스템의 사용은 정맥 천자시 캐스케이드 시스템의 활성화를 감소 항응고제의 자기 결정된 양의 사용을 허용하는 동안. 시판 진공 혈액 튜브 그러나, 연구의 의도 끝점에 따라 사용될 수있다. 대부분의 시판 폐쇄계 튜브에 첨가 항응고제의 최종 농도가 민감 억제 할 수 , 그렇지 않으면 하드 설정에서, 상호 작용을 연구합니다. (6) 보호 헤파린 표면이 더 내피 세포 이외의 다른 표면으로 표면 접촉을 통해 혈액의 활성화를 제거한다. (5) 실제로, 미분 획 헤파린의 소량 첨가 된 전체 혈액의 배양을 CHS의 보호없이 챔버는 혈전 형성의 결과. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 챔버 내부의 공기 거품 내피 세포 배양시 혈액의 혼합을 가능하게한다. 기포 크기의 영향을 평가하기 위해, 우리는 두 가지 혈액량을 사용했다. 이 모델에서는 HUVEC 배양 챔버에 관계없이 기포의 크기 TAT 비슷한 수준을 측정 하였다. TAT는하지만, 완전히 CHS에 작은 기포 크기가 증가 챔버 처리했다. 이것은, 전술 내피 세포의 특성 (11)에 따라, 불활성 CHS 챔버에서 결여되어 내피 세포에 의해 제공 응고의 증가 된 활성화시 조절 효과를 나타낸다. 시스템의 공기 방울은 챔버의 회전에 따라 흐름을 만듭니다. 거품의 크기는이 회전 시스템 내에서 힘에 영향을 미칠 것입니다. 이것은 작은 기포가 혈액 예에 따라 감소 된 힘을 나타내는 높은 TAT 값을 생성 그림 2D에서 우리의 결과에 의해했다 표시됩니다, 혈액 이동챔버는 낮고 캐스케이드 시스템의 활성화함으로써 높은 정도로 발생 내에. 그것은이 시스템에서 우리는 벽과 중앙에서 가장 낮은 함께 최고 속도로 챔버에서 속도 다를 수 있습니다 회전 흐름을 만드는 것을 언급해야한다. 이것은 분명히 내피 세포에 대한 흐름과 관련하여 전단 응력을 가진 최적의 환경 아니지만, 여전히 우리는 안정적이고 반복 가능한 결과를 생성하는 시스템을 갖는다. 더 최적의 조건은 난류의 부재 층류 순환 포함한다. 이 여기에 표현 된 모델에서, 그러나 불가능하며 우리의 지식에 이러한 시스템은 날짜에 사용할 수 없습니다. 시스템에 추가 항응고제없이 또는 낮은 수준으로 전체 혈액과 결합 할 수없는 몇 가지 미세 유체 시스템을 시판이 있지만함으로써 혈액과 혈관 내피 세포에 존재하는 모든 구성 요소 사이의 상호 작용의 적절한 민감한 평가를 가능하게 실패. 또한 TNFα는 독립적 혈액량의 TAT의 배 형성과 조합 HUVEC 활성화쪽으로 혈액 세포의 모집 2 배 증가 하였다. 이 모델 시스템의 안정성을 확인하고 또한 전혈과 함께 활성화 된 내피 세포를 사용할 수있는 가능성을 보여준다. 혈액 내피 세포 챔버는 다양한 조건 하에서 활성화의 단계에서 발현 세포 마커의 종류에 의해 활성화 된 내피 세포쪽으로 혈액 세포 모집을 조사하는데 사용될 수에 미래. 더욱이, 모델은 염증 상태에 대한 영향을 평가하기 위하여 약리학 적 제제와 조합하여 사용할 수있다. 요약하면, 우리는 혈관 질환 관련 조사를 수행하는 시험 관내 시스템에서의 완전한 인간을 만드는 사람의 혈액 및 혈관 세포 챔버 모델을 조합하는 큰 이점을 나타낸다.

심혈관 질환에서 혈액 혈관의 상호 작용을 분석하는 방법은 일반적으로 동물 연구 실험을 포함한다. 실험 연구 동물 모델에서 생성 된 결과 그러나. 인간의 질병에 대한 거의 또는 전혀 의미가 이와 같이 1,2- 수 혈액 구획과 혈관 내피 세포 간의 세포 상호 작용을 조사하는 시험 관내 모델에서 좋은 신뢰성에 대한 요구가있다 인간과 같은 시스템. 따라서 우리는 혈액 내피 세포 챔버 모델을 설립했다. 이 생체 물질과 인간의 전체 혈액 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용 이전에 설명한 모델을 기반으로합니다. 일반적으로 정제 된 구성 요소의 수를 제한 다른 시험관 설정 3는 달리 즉, 혈소판은 백혈구 나 내피 세포가 사용할 수 있으며, 본 모델은 모든 통합 성분은 혈관에 제시한다. 혈액 내피 (c)의 설치엘 실 모델은 거의 또는 전혀 추가 항응고제 갓 그려진 인간의 혈액의 사용을 가능하도록 설계되었습니다. 긴 시간 기간 동안 저장된 혈액은 그래서 적혈구의 파괴가 혈액과 혈관 내피 세포 사이의 미묘한 상호 작용을 방해 할 수있는 저장 병변라고 획득을 누릅니다. 4 생체 전체 혈액의 취급시 혈전 형성을 방지하려면 항응고제의 혈액과 접촉하는 모든 물질이 비 활성화 할 필요가 다량으로 복용 중 하나가 필요합니다. 비 - 활성화 된 표면은 실험실 환경에서 드문 같이, 물질은 별도로 고정 된 헤파린의 보호 층을 구비 할 수있다. 고정화 헤파린의 보호 층을 피 접촉은 응고 캐스케이드의 활성화를 야기하지 않고 발생할 수있는 표면을 생성 대부분의 물질에 적용될 수있다 (이하 Corline 헤파린 표면 (CHS)이라 함). (5)을 따라서 함께 챔버 가구하여 CHS, 혈액 내피 CELL 챔버 모델은 혈액에 항응고제의 매우 낮은 농도의 사용을 가능하게한다. 혈액 내피 챔버 모델에서 항 응고 고농도의 첨가를 피하는 것은 달리 마스킹 될 수있는 혈관 내의 중요한 상호 작용을 검토하는 것이 가능하다. (6) 플라스틱 현미경 슬라이드에 :; (9mm 반경 8mm 높이) 혈액 내피 세포 챔버 모델은 플라스틱 실린더를 부착하여 형성된 2 개의 챔버로 구성되어 있습니다. 실린더에 위로 향 가장자리가 세포 배양 슬라이드에 챔버를 밀봉에 사용되는 고무 O 링이 장착되어 홈이 장착되어 있습니다. 챔버는 부분적으로 챔버는 이후 수직 위치 (그림 1)으로 회전 할 때 실에 남아있는 공기가 운동에 혈액을 유지 혈액으로 가득 차 있습니다. 모델의 기능을 평가하기 위해, 우리는 하나 완전히 CHS 코팅 실험을 수행챔버 또는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC). 두 개의 분리 된 혈액 볼륨 측정 하였다 트롬빈과 안티 트롬빈 (TAT) 복합체 (응고의 간접 마커)의 형성은 효소 면역 분석법 (ELISA)으로 측정 하였다. 그런 다음 혈액 볼륨 및 종양 괴사 인자 (TNFα) 화상 해석에 의해 백혈구 보충에 내피 세포를 자극하는 효과를 평가 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg"> 혈액 내피 세포 챔버 모델 1. 설정을 그림. (A) 위쪽 PMMA에서 만든 혈액 챔버의 개략도를 볼 수 있습니다. (B) 1 차 인간의 내피 세포가 1 웰 챔버 슬라이드에서 배양한다. 신선한 인간 전혈은 현미경 슬라이드에 두 챔버에 첨가된다. 혈액을 처리하는 데 사용 챔버 및 모든 자료는 보호 HS 코팅으로 처리됩니다. CE의 벽을 제거한 후에LL 배양 슬라이드, 세포는 혈액 대향 배치되고 시스템은 셧을 클램프한다. (C) 혈액 내피 세포 챔버는 37 ° C에서 회전하에 배양 하였다. 그 후, 혈액 구획 반응은 ELISA에 의해 분석 될 수 있으며, 내피 세포를 현미경으로 분석 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>인간 움빌리칸 정맥 내피 세포(HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>다른 유형의 1차 인간 내피 세포를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 매체 MV (ECGM MV)</td> <td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G-2500</td><td>PBS에서 1 % 젤라틴을 준비하고 T75에서 5ml를 15 분 동안 배양 한 다음 세포를 배양하기 전에 제거합니다.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>효소 연구소</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11001</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>분자 프로브</td><td>D1306</td><td>희석 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 웰 세포 배양 슬라이드</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber는 PMMA 또는 기타 플라스틱으로 제조할 수 있습니다. 바인드 CHS</td></tr><tr><td>클램프</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>크기 : 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>분획되지 않은 헤파린 (UFH)</td> <td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>milliQ H2O로 0.34 M 원액 준비</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>www.cellprofiler.org 에서 무료로 제공</td></tr></tbody></table>

소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

알려진 모든 질병의 대부분은 심혈 관계 질환을 수반한다. 심장 혈관 병리 동안 활성화 된 상호 작용 경로의 복잡성에 대한 연구는, 그러나, 강력한 생리 학적으로 관련 방법의 부족에 의해 제한됩니다. 병적 혈관 사건을 모델링하기 위해, 우리는 내피 전혈 사이의 상호 작용을 연구하기위한 시험 관내 분석을 개발 하였다. 분석은 인간의 전체 혈액과 접촉에 배치됩니다 차 인간의 내피 세포로 구성되어 있습니다. 상기 방법은 혈관에 존재하는 분자 및 세포 성분 간의 미묘한 상호 작용 연구를 가능 거의 혹은 전혀 항응고제 네이티브 혈액을 이용한다. 우리 또는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 배양없이 다른 혈액 부피로 응고의 활성화를 비교함으로써 분석의 기능을 조사 하였다. 큰 혈액 부피에 기여하는 반면트롬빈 안티 트롬빈의 형성 증가 (TAT) 복합체, HUVEC의 존재는 응고 활성의 감소 결과. HUVEC는 종양 괴사 인자 (TNFα)로 자극과 혈액의 접촉 후 자극되지 않은 세포에 비하여 TNFα 세포 자극에 상당히 높은 것으로 CD16 + 세포의 존재를 발견에 더욱이, 우리는 백혈구의 부착 이미지 분석을 적용 하였다. 결론적으로, 분석은 내피 세포 및 혈액 구획 사이의 상호 작용을 교란되어 혈관 병리 현상을 연구하기 위해 적용될 수있다.

CHS 코팅의 필요성 내피 세포에 의해 유발 된 것과 특정 전혈에서 반응을 측정하기 위해, 혈액 내피 세포 챔버에 사용되는 모든 재료는 사용 전에 CHS 코팅으로 제공되어야한다.도 2a는 (왼쪽)의 30 분 후, 코팅 챔버를 도시 명확하게 볼 혈전 현재와 혈액의 접촉. 반면에, CHS와 챔버 (도 2A, 오른쪽)을 처리하여 결과 내피 세포 - 혈액의 상호 작용에 기인하도록 보장 제어되지 않은 활성화로부터 혈액을 보호한다. 챔버 내의 혈액 볼륨의 효과 활성화 응고 인자 사이의 상호 작용의 확률이 증가함에 따라 응고의 활성화는 정체 혈중 쉽다. 혈액 내피 세포 챔버 모델에서 혈액 인하여 챔버 내부의 기포의 순환 운동에 유지된다. O를RDER 따라서 또한 기포 크기 혈액량의 변화의 효과를 결정하고, CHS 코팅 챔버는 1.5 ml를 30 분 동안 1.75 ml의 전혈 테스​​트 하였다 CHS 코팅 된 유리 슬라이드에 연결되었다. 혈액 1.75 ㎖의 혈액을 1.5 ㎖의 (도 2B)를 사용하는 경우에 비해, 챔버에 추가 될 때 기포에 의한 운동이없는 혈액의 부피가 2.5 배 더 크다. 측정 된 TAT-값은 증가 혈액 볼륨 (그림 2D)와 TAT-형성을 증가 제안했다. HUVEC (도 2C)가 전혈 1.5 중 1.75 ㎖를 함께 배양 하였을 때, 차이는 내피 세포가 응고의 활성화 (도 2D)를 조절할 수 있음을 시사한다, 두 그룹간에 유의하지 않았다. 혈액 세포 모집에 TNFα의 효과와 응고의 활성화 백혈구 모집에 TNFα의 효과를 연구하기 위해, HUVEC은 치료했다20 NG와 ED / ㎖ TNFα 4 시간 혈액에 접촉하기 전에. 혈액 접촉 - 중 1.5 ml의 또는 1.75 ml의 혈액와 함께 -, 문화 슬라이드 CD16 (그림 2 층)에 대한 염색 된 후 30 분 동안 계속 이미징 및 CD16 + 세포의 수를 정량화 하였다. CD16 + 세포의 모집은 1.5 ml의 혈액 100 ~ 256 CD16 + 세포 / mm 2 (P &lt;0.0001)에서 TNFα 치료 (그림 2E)으로 크게 증가, 172에서 1.75 ml의 혈액 378 (P &lt;0.0001)에. TAT 복합체의 형성은 어느 TNFα가 처리되거나 비 처리 된 세포 (도 2G)와 함께 배양 혈액 대응 혈장 샘플에서 측정 하였다. 비 처리 된 세포에 비하여 TNFα 자극 된 세포는 TAT 복합체의 대략 배가를 유도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600"> 무화과URE 2 : 혈액 내피 세포 챔버 모델의 기능을 제공합니다. CHS 유무에 관계없이 (A) 챔버는 전체 혈액 배양 하였다. CHS없이 혈전을 30 분 후에 형성되었다. CHS없이 배양 혈액에서 트롬빈 - 안티 트롬빈 (TAT) 단지, 응고의 간접 마커의 측정&gt; 6,000 ㎍ / ㎖를했다. (B) 혈액의 볼륨은 다른 혈액 볼륨에 따라 달라집니다 회전 기포에 의해 움직이는 유지되지. 그것은 1.75 ㎖를 첨가하여 0.74 ml의 증가 반면 혈액 1.5 ㎖를 첨가하여이 부피는 0.3 ml의 것이다. 합류 단층의 위상차 현미경 쇼 전형적인 내피 세포 형태 앞서서와 (C) HUVEC 이미지화 다른 혈액 볼륨이 추가 될 때 혈액 접촉. (D) 완전히 CHS 코팅 챔버에 대한 TAT 값은 약간의 차이를 보여줍니다. 1.5 ml의 혈액의 첨가는 85 ml의 결과 1.75로 ± 11 ㎍ / ㎖ (N = 7)에 비하여 35 귀착77; 70 ㎍ / ml의 TAT (N = 8). HUVEC 동일한 혈액량 함께 배양 될 때 이러한 차이는 더 이상 존재하지 않는다; 1.5 ml의 66 ± 55 μg의은 / ㎖ (n = 5)으로 나누고, 66 ± 29 1.75 ㎖ (없음 7 =) 비자극 또는 TNFα 하나에서 CD16 + 세포의 수. (E) 부량 본이 후 HUVEC를 자극 용 ㎍ / ml의 혈액 접촉. 또는 1.75 ㎖ (기초 :; TNFα 중 하나를 1.5 ㎖ (256 ± 121 세포 / mm TNFα 100 ± 40 세포 / mm 기저) : 배양 세포를 자극하여 CD16 + 세포의 수는 크게 증가 172 ± 67 세포 / mm를; TNFα : 전체 혈액의 378 ± 185 세포 / mm) (F) HUVEC은 팔로이 딘 (적색 염색을 자극 비자극 및 TNFα의 대표 이미지), CD16 (녹색) 및 DAPI (파란색).. 스케일 바 = 250 μm의 혈액 (1.5 ㎖로 배양 처리하지 않은 세포에 비해 TAT 복합체의 형성은 약 TNFα에 의해 배가된다 (G) 세포를 자극 :. 2.1 ± 0.1 배 이상 TAT, N = 3; 1.75 ml의 1.7 ± 1.0 배의 TAT, N = 4). 모든 값은 평균 ± 표준 편차로 표시된다 P 값이 짝 t 테스트에 의해 계산 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

인간의 혈관 혈액 상호 작용을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델의 접근성이 부족합니다. 우리는 혈액(ELISA)과 혈관 구획(현미경) 모두에서 세포 상호 작용을 조사하기 위해 인간 전혈과 결합된 배양된 1차 인간 내피 세포의 체외 모델을 제시합니다.

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

이 절차의 전반적인 목표는 새로운 혈액 내피 챔버 분석을 사용하여 혈액과 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 개방 시스템 정맥 천자를 통해 건강한 지원자의 혈액을 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 내피 세포 배양 도금 슬라이드에 연결된 헤파린 표면으로 코팅된 혈액실에 혈액을 조심스럽게 층을 이룹니다.다음으로, 이러한 혈액 내피 세포실은 혈액과 내피 세포 간의 상호 작용을 촉진하기 위해 부드럽게 회전합니다. 궁극적으로, 혈액 세포와 내피 세포 간의 세포 간 상호 작용과 그에 따른 트롬빈 항트롬빈 복합체 생성은 각각 면역형광 현미경 검사와 Eliza로 평가할 수 있습니다. 동물 모델을 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 이점은 실험을 시작하기 전에 인간 모델 시스템을 사용하여 혈관 질환을 조사할 수 있다는 것입니다.18 게이지 피하 주사 바늘을 헤파린 표면 코팅된 실리콘 튜브의 내경 2mm 조각에 연결합니다. 플라스틱 표면은 응고의 불특이적 활성화를 방지하기 위해 헤파린으로 코팅되어 있습니다. 예를 들어, 이 이미지에서는 코팅되지 않은 챔버에서 혈전이 명확하게 보입니다.혈액 접촉 30분 후 챔버를 헤파린 표면으로 처리하면 제어되지 않은 활성화로부터 혈액을 보호하여 결과가 내피 세포 혈액 상호 작용에 기인하는지 확인합니다. 튜브를 연결한 후에만 50ml 헤파린 표면 코팅된 튜브에 개방형 시스템 정맥 천자를 통해 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 조심스럽게 수집합니다. 수집된 혈액에 분획되지 않은 헤파린을 보충하여 최종 농도인 밀리리터당 0.75IU에 도달하고 튜브를 두세 번 뒤집어 부드럽게 섞습니다.초기 혈액 단백질 농도를 분석하기 위해 30마이크로리터의 10밀리몰 K 3 EDTA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 튜브당 1ml의 혈액을 조심스럽게 혼합하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 헤파린 표면 코팅된 피펫 팁을 사용하여 1.5ml의 혈액을 헤파린 표면으로 코팅된 각 혈액 내피 세포실로 이동시키고, 혈액이 활성화되지 않도록 기포를 생성하지 않고 천천히 흐르도록 주의합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 내피 세포 배양 슬라이드에서 플라스틱 벽을 제거하고 내피 세포를 부드럽게 씻습니다.PBS를 사용하면 배양물이 마르지 않도록 세포에서 세척된 물을 최대한 많이 이동시키고 세포가 혈액을 향하도록 혈액실 위에 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음 추가 지지를 위해 플라스틱 슬라이드를 사용합니다. 세포 배양 슬라이드의 파손을 방지하려면 각 혈액 내피 세포실 주위에 클램프를 배치하여 슬라이드를 고정합니다.이제 섭씨 37도의 수조에서 0.5Gs의 회전 휠로 챔버를 30분 동안 회전시킵니다. 회전 후 혈액 내피 세포실을 해체하고 PBS에서 세포 배양 슬라이드를 세척하고 세포를 얼음처럼 차가운 1% 파라알데히드에 10분 동안 고정합니다. 마지막으로, 활성화된 혈액 단백질 농도를 평가하기 위해 각 챔버에서 1ml의 혈액을 30마이크로리터의 0.34몰 K 3 EDTA가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합하고 튜브를 최대 1시간 동안 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 세포를 회전시킨 후 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 영하 70도의 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에 플라즈마를 보관합니다. 응고 인자의 활성화는 활성화된 인자 간의 상호 작용 확률이 증가함에 따라 정체된 혈액에서 발생할 가능성이 더 높습니다. 실제로, 기포에 의해 아무런 움직임이 없는 혈액의 양은 2.5배 더 많습니다.1.5ml의 혈액을 사용할 때와 비교하여 1.75ml의 혈액을 챔버에 첨가하면 측정된 트롬빈 항트롬빈 값은 혈액량도 증가하면서 트롬빈 항트롬빈 형성이 증가함을 시사합니다. 흥미롭게도, ve가 두 부피의 전혈로 배양될 때, 두 그룹 간에 차이가 나타나지 않았는데, 이는 내피 세포가 백혈구 모집에 대한 TNF 알파의 효과를 연구하기 위해 응고의 활성화를 조절할 수 있음을 시사합니다. 이 실험에서, qve는 혈액 접촉 4시간 전에 TT NF 알파 밀리리터당 20나노그램으로 처리되었으며, 그 후 CD 16 양성 세포의 수를 정량화했습니다.TNF 알파 처리로 CD 16 양성 세포의 동원은 100에서 256으로, 평방 밀리미터 및 1.5 리터의 혈액 당 16 개의 양성 세포로, 혈액의 경우 172 개에서 378 및 1.75 밀리리터로 크게 증가했습니다. 그런 다음 트롬빈 항트롬빈 복합체의 형성을 TNF 알파 처리 또는 처리되지 않은 세포와 함께 배양한 혈액의 해당 혈장 샘플에서 측정했습니다. 예상대로, TNF 알파 자극 세포는 개발 후 처리되지 않은 대조군에 비해 트롬빈 항트롬빈 복합체의 약 두 배를 유도했습니다.이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 인간 일차 세포와 인간 전혈을 사용하여 체외 모델에서 탐구, 보완 및 응고할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

이 프로토콜은 레이저 컷 신경 혈관 임플란트를 사용하여 혈액 접촉 장치의 포괄적 인 혈전 성 평가를 설명합니다. 신선한, 헤파린화 인간의 혈액과 흐름 루프 모델은 혈류를 모방하기 위해 적용됩니다. 관류 후, 다양한 혈액학적 마커를 분석하고 시험된 장치의 혈적합성 평가를 위해 혈액 수집 직후 얻은 값과 비교한다.

인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

여기에 제시된 시험관 내 혈역학 루프 모델에 대한 표준화된 프로토콜이 있습니다. 이 모델은 ISO(국제표준화기구) 표준 10993-4에 따라 관류 관 또는 혈관 스텐트의 혈중 호환성을 테스트할 수 있습니다.

혈관 의료 기기의 혈혈성 호환성 및 호스트 세포 활성화를 조사하는 시험관 헤모역학 루프 모델

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

배우세요 인간 전혈과 내피 세포 상호작용을 연구하는 새로운 시험관 모델을 활용한 혈관생물학 기법입니다. 이 방법은 혈전-항혈전 복합체 형성과 면역 반응을 분석하여 혈관 질환 연구에 활용됩니다.

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