在 MyD88的介导的细胞免疫应答西尼罗河病毒变异株感染体外分析

本研究的总体目标是引入两种基于流式细胞术的免疫学测定，用于测量体外 T 细胞引物测定树突状细胞或从 West Nll 病毒感染小鼠中纯化的 dcs 中细胞介导的对西尼罗河病毒感染的免疫反应。在卵肽存在下，从 OT 两只转基因小鼠中纯化的幼稚 CFSE 标记的 T 细胞共培养。然后在生物安全二级实验室中通过流式细胞术分析T细胞的增殖反应，在改良的细胞内细胞因子染色测定中分析来自西尼罗河病毒感染小鼠的PLE细胞，在微量离心管中用西尼罗河特异性肽刺激离体，然后细胞维持细胞内细胞因子的产生，并在生物安全二级实验室中通过流式细胞术在管中进行分析。

最终，这些方法可用于检查特定信号通路在西尼罗河病毒感染动物 T 细胞激活中的作用，并且它们显着缩短了生物安全三级设施内的执行时间。虽然这种方法可以提供对西方 N 病毒细胞免疫的见解，但它也可以应用于其他生物安全三级病原体进行体外 T 细胞引物测定。首先从野生型 C 57 black six A、my D 8 8 敲除小鼠中分离脾树突状细胞接种西尼罗河病毒，并根据制造商的说明用抗 CD 11 C 磁珠对照未感染的动物。

然后分离 T 细胞，用两张载玻片的磨砂端将从 OT 两只小鼠解剖的脾脏匀浆，将细胞悬液转移到 15 毫升锥形管中，然后加入 RPMI 培养基至最终体积为 40 毫升。让细胞静置 5 分钟，然后将 30 mL 新生抗体转移到新的 50 mL 锥形管中。接下来，根据制造商的说明使用 CD 4 阳性 T 细胞分离试剂盒对 CD 4 阳性 T 细胞进行分类，然后将收集的细胞转移到 50 毫升锥形管中，然后在 PBS 中洗涤两次第二次洗涤后，在 PBS 中孵育细胞，一次用每毫升 6 个细胞的 0.5% 和 0.5 微摩尔/毫升的 CFSE 在 37 摄氏度下孵育避光 10 分钟后，将细胞在 5 mL 冷的完全培养基中置于冰上孵育 5 分钟。

然后在另一次 PBS 洗涤后，在 2%PFA 中将 0.2 乘以 10 固定到六个 CFSE 标记的 CD 四个阳性 T 细胞中，并通过流式细胞术测定 T 细胞 CFSE 表达的基础水平。重新悬浮其余的 CFSE 标记细胞，不完全，培养基，然后单独培养 2 次 10 至 5 次纯化的 2 次 2 次 CD 4 个阳性 T 细胞或2 次 10 次 4 次纯化的野生型或我的 D 8 8 个敲除直流，在 24 孔板中含有或不含有 1 微克/毫升的残留物 3 23 3 39 在每孔 1 毫升完全培养基中，浓度为 37五天后，收获细胞并在 FACTS 缓冲液中洗涤两次，并将沉淀固定在 0.25 毫升 2% PFA 中，并立即涡旋样品以进行流式细胞术数据采集。双击流式细胞术软件，在前向散射上选择 0 到 200， 000 的通道，在侧向散射上选择 0 到 200， 000 的通道，以生成密度图。

然后在活孔上创建一个门来分析 CFSE 的荧光强度。打开 FL 单通道的直方图，并在门控总体上获取 20， 000 个事件。然后在样品上为单独培养的 OT 两个细胞设置一个标记。

以类似的方式获取OT 2细胞与野生型共培养或my D 8 8 knockout dcs的数据，用于细胞内细胞因子染色测定。从西尼罗河病毒收获的脾脏生成单细胞悬液后，感染小鼠在适当的时间点对细胞进行计数，然后用完全培养基将其稀释至每毫升浓度 6 个细胞的 2.5 倍。接下来，Eloqua 将 1 毫升细胞放入 1.5 毫升微量离心管中。

然后，为了刺激 CD 8 个阳性 T 细胞，加入 10 微升新鲜稀释的蛋白质特异性肽，然后加入 1 微升 feld。在溶液中，小心混合细胞悬液，然后用 18 号针头在管盖上打两个孔，并将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 小时。将细胞转移到新的微量离心管中并在洗涤 1 毫升传真缓冲液后将其旋转后，将第二个沉淀重新悬浮在 120 微升传真缓冲液中。

然后用 FC 阻断非特异性结合位点，并用适当的实验和对照抗体标记试管，如表所示。接下来，将细胞在固定和渗透缓冲液中孵育，然后将细胞转移到生物安全水平的实验室，根据表格使用对照或抗干扰素 γ 抗体进行标记。为了测量细胞内细胞因子的产生，如刚才所示，设置一个正向并排散点图，然后使用补偿管对活细胞进行门控，以根据需要调整电压。

创建一个点图来显示为 CD 8 阳性与干扰素 γ 阳性细胞收集的数据，然后是另一个为 CD 4 阳性与干扰素 γ 阳性细胞收集的数据，并为每个样品的门控群体采集 50， 000 个事件。在本实验中，对总 C 细胞进行门控以确定基础 T 细胞增殖率。在没有与 dcs 共培养的情况下。

当 T 细胞与从西尼罗河病毒感染动物中分离的 DC 共培养时，CFSE 阳性 T 细胞表现出 87% 的增殖 CFSE 标记的 T 细胞在过度存在的情况下与 my D 8 8 敲除小鼠的 DCS 共培养表现出 74.5% 的增殖率，表明 my D 8 信号通路的缺陷导致突变 West 无效期间 dcs 的抗原呈递能力受损病毒感染。在该代表性图中，从西尼罗河病毒感染的野生型小鼠中分离的脾 CD 4 阳性干扰素 γ 阳性和 CD 8 阳性干扰素 γ 阳性 T 细胞的百分比分别为 0.4% 和 1.7%。虽然从西尼罗河病毒感染我的 D 8 8 基因敲除小鼠中分离的双阳性脾 T 细胞的百分比仅为 0.2% 和 0.6%对从未感染小鼠中分离的细胞进行了类似的分析，在两组之间未观察到双阳性群体 T 细胞的百分比差异。

此外，来自感染野生型小鼠的 CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞的单个阳性群体分别占总门控 SP 细胞的 21% 和 13.3%，而与感染组相比，它们仅占 my D 8 8 基因敲除 SP 细胞的 15.9% 和 11.2%，与 my D 8 8 基因敲除小鼠相比，my D 8 基因敲除小鼠的 CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞反应均降低到突变的 West Snail 病毒感染后第 8 天的野生型组。总之，我的 D 8 信号传导参与两个群体的初始 T 细胞活化，并有助于在感染后期导致 CD 4 阳性 T 细胞反应。在 CFSE 中使用 OT 两个 T 细胞的基于体外 T 细胞引物酶的流感细胞术可以更准确地测定增殖的 CD4 阳性 T 细胞的百分比，与当前的标准方案相比，总体灵敏度显著提高。

微场管 ICS Math third 不需要任何特殊仪器，这为研究人员提供了一些更经济、更灵活的选择。