Name: Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie die Lentivirus-basierte Transduktion von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen für In-vitro-Myelinisierungsassays. Diese Methode ermöglicht die selektive Überexpression von Proteinen zur Untersuchung zentralnervöser Myelinisierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC-Stipendium #454330 für JX, Projektstipendium #628761 für SM und APP1058647 für JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 für JX), das University of Melbourne Research Grant Support Scheme und das Melbourne Research CI Fellowship für JX sowie die australischen Postgraduiertenstipendien für HP und AF. Wir möchten das Operational Infrastructure Scheme der Ministerium für Innovation, Industrie und regionale Entwicklung, Victoria, Australien.

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt in Bezug auf diese Forschung gibt.

Myelinisierung von Axonen ist eine entscheidende Prozess für die optimale Funktion von sowohl den zentralen und peripheren Nervensystems von Wirbeltieren. Die Erzeugung und Wartung von myelinisierten Axonen ist ein komplexer Prozess, und koordinierte molekulare Wechselwirkungen zwischen neuronalen, glialen (von Schwann-Zellen oder Oligodendrozyten) und extrazellulären Matrixproteinen. Die Bedeutung und die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist, dass es ermöglicht die Manipulation von Proteinen in einem spezifischen Zellty...

Myelinisierung von Axonen ist entscheidend für die schnelle und effiziente Übertragung von Aktionspotentialen in den beiden zentralen und peripheren Nervensystemen. Spezialisierte Zellen, Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem und Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem, Wrap-around und ensheathe Axone im Myelin, effektiv Isolierung der Nerven und saltatorische Erregungsleitung 1 zu erleichtern. Der Prozess der Myelinisierung in vitro unter Verwendung von retinalen Ganglienneuronen 2, konstruiert Nanofasern 3 oder Dorsalwurzelganglionneuronen cokultiviert entweder mit Schwannschen Zellen 4 oder Oligodendrozyten 5-7 untersucht werden. Die In-vitro-Assay Myelinisierung ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Nervensystems Myelinisierung und viele der grundlegenden Prozesse, die während der Myelinisierung in vivo 8.5 auftreten repliziert. Der Test beinhaltet die Co-Kultur von gereinigten Populationen von Spinalganglion (DRG) Neuronen, mit OPC (für C-NS Myelinisierung) oder Schwann-Zellen (für PNS Myelinisierung). Unter bestimmten Bedingungen sind diese Zellen myelinisierenden ensheathe DRG Axone im befahl, ultra strukturell überprüft, multilamellaren Folie aus isolierendem Plasmamembran, die die gleiche Ergänzung von Myelin in vivo vorhanden spezifische Proteine ​​zu exprimieren. Das am häufigsten verwendete Zellmodell zu studieren CNS Myelinisierung in vitro ist die Co-Kulturen von DRG-Neuronen und OPCs, die erfolgreich verwendet wurden, um den Effekt, dass exogene Faktoren wie Neurotrophine auszuüben auf CNS Myelinisierung in vitro 5,6 studieren. Exogene Faktoren, wie Wachstumsfaktoren oder kleines Molekül pharmakologische Inhibitoren wurde weithin verwendet, um die Rolle von Signalwegen in der Myelinisierung mit der DRG-OPC Kokulturmodell 7,9 studieren. Jedoch in den Misch Kokultur Einstellungen, die sowohl die Neuronen und Oligodendrozyten enthalten, formell möglich blieb, daß entweder die Wachstumsfaktoren oder die pharmacological Inhibitoren könnte Auswirkungen auf sowohl die DRG-Neuronen und Oligodendrozyten (OL) ausgeübt haben. Hier bietet sich die Möglichkeit, gezielt zu sezieren die Rolle, dass die Proteine ​​nur durch DRGs ausdrücklich oder Oligodendroglia übt auf die Myelinisierung mit dieser Zwei-Zellen-System. Um zweifelsfrei bestätigen, dass der Signalweg in oligodendroglialen Myelinisierung, lentivirale Transduktion OPCs vor auf DRG-Neuronen für die In-vitro-Assays Myelinisierung Aussaat, hat sich eine elegante Möglichkeit, sowohl Wildtyp und mutierten Proteine ​​überexprimiert werden, aber auch direkt reguliert als Zuschlags Ausdruck konstitutiv exprimierten Proteine, die von Oligodendrozyten. Damit bietet dieser Ansatz einen Weg, um gezielt abzufragen und zu manipulieren Signalwege innerhalb Oligodendrozyten zum Studium Myelinisierung 9,10. In diesem Papier Methoden, die wir selektiv in Oligodendrozyten über einen lentiviralen wurden entwickelt, um ein Protein von Interesse überexprimiert berichten wirAnsatz für das Studium Myelinisierung in vitro. Die Technik beginnt mit der Erzeugung von Expressionsvektoren, die das Gen von Interesse enthält, sei es in einem Wildtyp, konstitutiv aktiven oder dominant negative Form, die dann anschließend in der pENTR Vektor (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) kloniert werden. Dieser Vektor (der das Gen von Interesse), sind der CMV-Promotor-Donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) und das 2K7 lentivector in einer Enzymreaktion kombiniert, um eine 2K7 Vektor, CMV-Promotor, das Gen von Interesse, ein produzieren interne Ribosomenbindungsstelle und GFP (Abbildung 1). Diese Gateway-geklonten 2K7 Konstrukt kombiniert mit der PMD2.G Virushülle und dem pBR8.91 Virus-Paket kann in HEK293T-Zellen cotransfiziert, um Lentiviren, die später verwendet werden, um OPCs transduzieren erzeugen. Einmal mit dem Lentivirus infiziert die OPCs Ausdruck ein hohes Maß an das Protein von Interesse. Diese OPC kann dann auf DRG Neuronenkulturen ausgesät werden und die Wirkung, dass die Expressionvon hohen Niveaus des gewünschten Proteins übt auf die Myelinisierung abgefragt werden. Die Co-Kulturen werden auf Myelin-Protein-Expression durch Western-Blot-Analyse untersucht und für die Bildung von myelinisierten Axonen Segmente durch Immunzytochemie visualisiert.

<table><tbody><tr><td>2K7 Lentivektor&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Freundliches Geschenk von Dr. Suter9</sup</td></tr><tr><td>>5-Fluoro-2&prime;-Desoxyuridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Neuronale Ergänzung</td><td>Stammzelltechnologien&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Mensch)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (d-Biotin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Fluoreszenz-Eindeckmedien</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Calcium, Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Eintrittsvektoren für Promotor und Gen von Interesse</td><td></td><td></td><td>Generieren gemäß den Protokollen 1-2</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glukose (D-Glukose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Siehe Lagerlösungen</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Ratte IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Siehe Lagerlösungen</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Siehe Lagerlösungen</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin - 200 mM (100x) flüssig</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus Enzym</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, ohne Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td> Maus &alpha<td></td></tr><tr><td>; &beta; III Tubulin&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>Maus & alpha; MBP (monoklonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na pyruvat&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (Maus)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>O1-Antikörper - Maus Anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternative, wenn O1-Hybridomzellen nicht verfügbar</td></tr><tr><td>sind O1-Hybridomzellen</td><td></td><td></td><td>Konditioniertes Medium mit Anti-O1-Antikörper zur Verwendung zur Immunpanierung</td></tr><tr><td>O4-Antikörper - Maus Anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternative, wenn O4-Hybridomzellen nicht verfügbar sind</td></tr><tr><td>O4-Hybridomzellen</td><td></td><td></td><td>Konditioniertes Medium mit Anti-O4-Antikörpern zur Verwendung für die Immunpanierung</td></tr><tr><td>Kompetente Zellen</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl kompetente Zellen</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Papain Suspension</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Freundliches Geschenk von Dr. Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Mensch)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x Lösung</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tablette (Complete mini)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td></td><td>Geliefert mit dem Clonase-Enzym</td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen & Alpha-Neurofilament</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen & Alpha; MBP (polyklonal)</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2-Hybridomzellen</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>Konditioniertes Medium mit Anti-Ran2-Antikörper zur Verwendung zur Immunpannierung</td></tr><tr><td>Ratte anti-CD140A/PDGFRa-Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC-Medium</td><td></td><td></td><td>Lieferung mit kompetenten Bakterien</td></tr><tr><td>Natriumselenit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Puffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE Puffer pH8</td><td></td><td></td><td>Siehe Stammlösungen</td></tr><tr><td>TNE Lysepuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spurenelemente B</td><td>Zellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin (Apo-Transferrin human)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor aus Hühnereiweiß</td><td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x), Phenolrot (0,05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Unkonjugiertes Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und verwendung von lentivirus, um selektiv zu transduzieren primäre oligodendrozyten vorläuferzellen für in-vitro- myelinisierung assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelinisierung ist ein komplexer Prozess, der beide Neuronen und das Myelin bilden Gliazellen umfasst, Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS). Wir verwenden ein in vitro Assay Myelinisierung, ein etabliertes Modell für die Untersuchung CNS Myelinisierung in vitro. Um dies zu tun, werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC), um die gereinigte primäre Nager dorsalen Wurzelganglien (DRG) Neuronen hinzugefügt myelinisierenden Kokulturen bilden. Um spezifisch zu verhören, die Rollen, die bestimmte Proteine, die von Oligodendrozyten exprimiert auf Myelinisierung auszuüben haben wir Protokolle, die selektiv zu transduzieren OPCs mit dem Lentivirus überexprimieren Wildtyp, konstitutiv aktiv oder dominant negative Proteine, bevor sie auf die DRG-Neuronen ausgesät entwickelt. So können wir gezielt befragen die Rolle dieser Proteine ​​bei der Regulierung oligodendroglialen Myelinisierung. Die Protokolle können auch bei der Untersuchung von ot aufgetragen werdenihren Zelltypen und bietet somit einen Ansatz, der selektiven Manipulation von Proteinen durch einen gewünschten Zelltyp exprimiert wird, wie beispielsweise Oligodendrozyten, für die gezielte Untersuchung von Signalisierungs- und Kompensationsmechanismen ermöglicht. Zusammenfassend, die Kombination der In-vitro-Assays mit Myelinisierung lentiviralen infiziert OPCs eine strategisches Instrument für die Analyse der molekularen Mechanismen in Myelinisierung beteiligt.

Das Flag-markierten extrazellulären Signal-bezogene Kinase 1 (Flag-Erk1) Konstrukt für Lentivirus Produktion verwendet wird durch Restriktionsenzym verdauen prüft der verwendeten Konstrukte, die sowohl die 2K7 Konstrukte und die für die Virusproduktion erforderlichen Verpacken und Zusatz-Konstrukte (Abbildung 3) . <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> Figur 3: DNA-Konstrukt Verifikation.</stron...

Hier präsentieren wir Protokolle, die eine flexible und strategische Grundlage für die virale Manipulation von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen bieten, um interessante Proteine zu überexprimieren, um ihre Rolle in Oligodendrozyten spezifisch über das in vitro-Modell der Myelinisierung des Zentralnervensystems zu untersuchen.

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs viral zu manipulieren, um Proteine von Interesse zu überexprimieren. Für die In-vitro-Studie der ZNS-Myelinisierung Nation wird dies durch die erste Klonierung eines lentiviralen Vektors erreicht. Die nächsten Schritte sind die Herstellung des Lentivirus und die Bestimmung der optimalen Viruskonzentration für das Experiment.Anschließend werden präparierte und kultivierte OPCs mit dem Lentivirus transduziert. Der letzte Schritt besteht darin, die transduzierten OPCs auf kultivierte Neuronen zu säen, die aus dem DRG seziert wurden. Letztendlich werden die myelinisierenden Co-Kulturen mittels Western-Blot-Analyse auf Myelinproteinexpression untersucht und durch Immunfärbung für die Bildung myelinisierter axonaler Segmente sichtbar gemacht.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. pharmakologischen Werkzeugen, besteht darin, dass der lentivirale Ansatz es uns ermöglicht, entweder Wildtyp- oder mutierte Proteine in unserem gewünschten Zelltyp, wie in diesem Fall Oligodendrozyten, selektiv zu überexprimieren. Zur Vorbereitung klonen Sie die erforderlichen 2K-Vektoren mit sieben geliehenen Vektoren, wie im Textprotokoll beschrieben, am Morgen des Tages der Transfektion, 32 Millionen HEK 2 93 T-Zellen in einem T 1 75-Kolben mit 25 Millilitern Medium herstellen. Entscheidend ist, dass diese Zellen vor der Transfektion festgeklebt werden müssen, also plattieren Sie sie bei Bedarf früher. In einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen wird ein Mastermix für die Transfektion des T 1 75-Kolbens hergestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben, DNA in den warmen DMEM-Vortex gegeben, dann zuletzt steriles PEI hinzugefügt, um eine vorzeitige Ausfällung zu vermeiden.Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen drei- oder viermal umdrehen und dann die Mischung etwa 15 Minuten lang auf der Bank inkubieren. Wechseln Sie das Medium auf den Zellen und fügen Sie dann die Transfektionsmischung hinzu. DROPWISE mischt das Medium vorsichtig über die Zellen und inkubiert die Zellen dann über Nacht.Am nächsten Tag. Die GFP-Expression kann durch Fluoreszenzmikroskopie überprüft werden. 48 Stunden nach der Transfektion entnehmen Sie die erste Charge des Virusüberstands und geben Sie 25 Milliliter frisches Medium in die Zellen.Zentrifugieren Sie den Virusüberstand bei 1.140 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Virusüberstand ohne das Pellet der Zelltrümmer in ein neues Röhrchen und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Entnehmen Sie am nächsten Tag, 72 Stunden nach der Transfektion, die letzte Charge der Virusüberstandszentrifuge, um die Zelltrümmer zu entfernen, und legen Sie eine Zelle mit der ersten Charge des geklärten Virusüberstandes.Konzentrieren Sie dann das Virus, indem Sie den Virusüberstand 90 Minuten lang bei 170.000 g ultrazentrifugieren. Bei vier Grad Celsius. Entladen Sie die Ultrazentrifuge und gießen Sie den Überstand weg, so dass ein Gaumen mit gefälltem PEI und dem Virus zurückbleibt, der am Boden des 30-Milliliter-Röhrchens nicht sichtbar ist.Wiederholen Sie diesen Vorgang. Zentrifugieren Sie alle viralen Supernat in Chargen in denselben 30-Milliliter-Röhrchen, um das Virus zu konzentrieren und das Virus in jedem Ultrazentrifugenröhrchen zu resuspendieren. Geben Sie 500 Mikroliter Sato-Medien hinzu und decken Sie die Tube mit Folie ab.Wirbeln Sie dann das Röhrchen 30 Sekunden lang vor und lösen Sie das Pellet mechanisch mit einer Pipettenspitze. Wiederholen Sie diesen Zyklus des gelösten Wirbels etwa sechsmal, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig in das Sato-Medium suspendiert ist. Sammeln Sie nun alle resuspendierten Viren in Sato in einem frischen Mikroröhrchen.Schleudern Sie den gepoolten Überstand eine Minute lang kurz bei maximaler Geschwindigkeit herunter. Um das PEI zu pelletieren, sammeln Sie den Überstand, der das Virus enthält, und filtern Sie, indem Sie die Lösung mit einer Spritze durch einen 0,45-Mikron-Filter leiten, um sie einzuwickeln. Aliquotieren Sie das gereinigte Virus in Sedia in 2050- und 100-Mikroliter-Volumina und lagern Sie sie alle bei minus 80 Grad Celsius.Für dieses Protokoll haben primäre Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. OPCs, die in 10 Zentimeter großen Platten mit 10 Millilitern Sedia kultiviert werden, die die folgenden Wachstumsfaktoren enthalten, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT drei, und für die Zellen müssen 24 Stunden lang unter 8% Kohlendioxid kultiviert worden sein. Beginnen Sie mit dem Ansaugen des Mediums und entfernen Sie es vollständig.Ersetzen Sie es dann durch 10 Milliliter des gleichen Mediums mit den Wachstumsfaktoren. Infizieren Sie Ihre OPCs mit Lentiviren und exprimieren Sie das Protein von Interesse, indem Sie das erforderliche Virusvolumen tropfenweise in das Medium geben. Ebenfalls in einer separaten OPC-Platte mischen Sie das Kontroll-Lentivirus, das nur GFP exprimiert, in die Medienkultur, die Zellen für weitere 48 Stunden.Sammeln Sie dann die OPCs von den Platten, um sie auf die kultivierten GRG-Neuronen zu säen. Spülen Sie zunächst jede Platte zweimal mit acht Millilitern EBSS aus. Bilden Sie einen Milliliter Trypsin EDTA 0,05% mit neun Millilitern warmem EBSS.Geben Sie fünf Milliliter des verdünnten Trypsins auf jede Platte. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für bis zu zwei Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie fünf Milliliter 30% FBS in EBSS hinzufügen.Dann mit einer 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie die OPCs von der Plattenoberfläche. Drehen Sie die Platte jedes Mal um eine Vierteldrehung, um alle Zellen zu sammeln.Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 180 Gs. Aspirieren Sie nun den Überstand und die Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter warmem Saddo-Medium ohne Wachstumsfaktoren und zählen Sie die Zellen.Bereiten Sie als Nächstes die DRG-Neuronen vor, die auf den 22-Millimeter-Deckgläsern kultiviert werden, indem Sie das Medium vollständig von ihrer Platte absaugen. Säen Sie dann vorsichtig 200.000 OPCs tropfenweise auf jeden Deckglas. Das Aussaatvolumen muss weniger als 200 Mikroliter pro Deckglas betragen.Lassen Sie die Zellen sich absetzen, ohne die Platte zu bewegen. Nach 10 Minuten befüllen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter warmem Pulver. Wiederholen Sie nun die verbleibenden Schwester-OPCs. Da sie Wachstumsfaktoren enthalten, können sie später zur Überprüfung der Expression des interessierenden Proteins verwendet werden.Eine Flagge markierte die extrazelluläre signalbezogene Kinase. Ein Konstrukt wurde für die Einschränkung der Lentivirusproduktion verwendet: Enzyme wurden verwendet, um das Verpackungskonstrukt zu verifizieren, und das Zubehörkonstrukt, um die optimale Virusverdünnung für die Verwendung auf den OPCs zu bestimmen. Das IR-1-Lentivirus wurde in HEK 2 93 T-Zellen bei einem Bereich der viralen Verdünnung zu HEK 2 93 T-Zellen titriert.Die Expressionsniveaus des interessierenden Gens nahmen mit der Zeit zu. Anschließend wurden gereinigte OPCs infiziert und mindestens zwei Tage lang kultiviert, um die Transgenexpression sicherzustellen. Die FLAG- und GFP-Spiegel wurden in den Schwester-OPCs bestätigt.Die OPCs wurden dann auf DRG-Neuronen gesetzt. Die OPCs differenzierten sich dann zu Oligodendrozyten und begannen, wie von Westlern beurteilt, Myelinproteine zu exprimieren. Einige reife Oligodendrozyten myelinisiert, was durch MBP-färbende Axone sichtbar gemacht wurde, wurden mit Neurofilament oder Beta-3-Tubulin gefärbt, um sicherzustellen, dass die Axondichten berücksichtigt wurden.Bei der Analyse des Myelinisierungsgrades Nach der Aussaat der OPCs ist es wichtig, sich zu kultivieren. Die Schwester-APCs. Auf diese Weise kann die Expression des interessierenden Proteins oder des Tags auf dem Protein of Interest in den Schwester-APCs verifiziert werden, wenn dies in der Co-Kultur nicht möglich ist.

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten...

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Das Video demonstriert ein Protokoll zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in Oligodendrozyten und zur Induktion der Myelinisierung in einer Co-Kultur mit Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG). Die OPCs werden mit lentiviralen Vektoren transduziert, die für ein Signalprotein kodieren, das die Myelinisierung reguliert. Die transduzierten OPCs werden mit DRG-Neuronen co-kultiviert, um die Differenzierung in Oligodendrozyten und die Signalprotein-induzierte...

Ein in vitro Transduktions-induzierter Myelinisierungsassay für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des Zentralnervensystems. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung ihrer Vorläufer, der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, aus der Rattenrinde sowie eine schnelle und zuverlässige quantitative Methode zur Bewertung der Oligodendrogenese in vitro als Reaktion auf experimentelle Faktoren.

Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Lernen Sie die Lentivirus-basierte Transduktion von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen für In-vitro-Myelinisierungsassays. Diese Methode ermöglicht die selektive Überexpression von Proteinen zur Untersuchung zentralnervöser Myelinisierung.

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays (Video) | JoVE Journal

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

Weitere Videos entdecken