في المختبر توصيف الوظيفي للماوس القولون والمستقيم وارد النهايات

الهدف العام من التجربة التالية هو التوصيف الوظيفي للنهايات العصبية الواردة الخارجية في المستقيم لدى الفأر في المختبر. ويتم تحقيق ذلك من خلال استئصال المستقيم والقولون معماك العصب الحوضي أو القطني المتصل بهما بشكل متصل، ووضع النسيج في غرفة تسجيل مخبرية. وكخطوة ثانية، يتم تقسيم جذع العصب الحوضي أو القطني إلى خيوط دقيقة بحيث يمكن إجراء تسجيلات كهروفيزيولوجية للألياف المفردة للمحاور العصبية الفردية. بعد ذلك، يتم تحديد النهايات العصبية القولونية والمستقيمية الفردية عن طريق التحفيز الكهربائي غير المنحاز للمجالات المستقبلة، وتصنيفها وظيفياً بناءً على ملفات الاستجابة لثلاثة محفزات ميكانيكية متميزة.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار الاستجابات للمواد الكيميائية التي يتم تطبيقها على النهايات العصبية عن طريق عزل المجال الاستقبالي باستخدام قطعة من الأنابيب النحاسية واستبدال المحلول بمحلول يحتوي على المادة الكيميائية أو خليط من المواد الكيميائية. وتُظهر النتائج أن القولون والمستقيم لدى الفأر يتم تعصيبهما بواسطة خمس فئات مختلفة من النهايات العصبية الحساسة ميكانيكياً. علاوة على ذلك، فإن حوالي 25% من النهايات العصبية في القولون والمستقيم غير حساسة ميكانيكياً أو تعتبر مستقبلات ألم صامتة.

نستخدم هذه الطريقة، كما يفعل آخرون، لدراسة التعصيب الحسي للقولون والمستقيم. ويهمنا استخدام هذا النهج البحثي لأن العديد من اضطرابات الجهاز الهضمي ترتبط بفرط التحسس أو بتغير في استثارة التعصيب الحسي. ويرتبط اهتمامنا بفهم آليات فرط التحسس برغبتنا في المساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية قد تكون مفيدة لاحقاً في تعديل الألم وعدم الارتياح المرتبط عادة بهذه الاضطرابات الهضمية، مثل متلازمة القولون العصبي.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، نظراً لأن خطوات تشريح الأنسجة وفصل الأعصاب يصعب إتقانها للغاية. ويمكن أن تتعرض الأعصاب التي تغذي الجزء البعيد من القولون والمستقيم للتلف بسهولة أثناء عملية التشريح.

وبالتالي، فإن التشريح الدقيق وخطوات الفصل تعد بالغة الأهمية لمن يرغب في تكرار هذه التجربة. فمباشرة بعد قتل الفأر رحيمًا، قم بتفريغه من الدم، وافتح التجويف الصدري، واثقب الأذين الأيمن، ثم اغمر جثة الفأر في حوالي نصف لتر من محلول Creb المبرد بالثلج. بعد ذلك، قم بإزالة جميع الأحشاء بعناية باستثناء القولون والأعضاء الحوضية.

بعد ذلك، يتم قطع جسم الفأر عرضياً عند مستوى T 12 تقريباً، فوق الحجاب الحاجز الصدري قليلاً، ونقل النصف السفلي من الجسم إلى غرفة تشريح تحتوي على محلول bubble crebs مبرد بالثلج. وباستخدام المجهر التشريحي (stereoscope)، يتم استئصال المثانة والأعضاء التناسلية عن طريق القطع عند نقاط اتصالها بالإحليل. كما يتم استئصال الأبهر النازل وصولاً إلى نقطة تفرعه إلى الشرايين الحرقفية المشتركة.

الآن، قم بتحرير الأعصاب الحوضية أو الأعصاب السرجية القطنية من الأنسجة المحيطة. تتبع الأعصاب من خارج العرف الحرقفي وصولاً إلى نقطة دخولها في العمود الفقري. تدخل الأعصاب الحوضية في الفقرات L6 و S1، بينما تدخل الأعصاب السرجية القطنية في الفقرات T13 و L1 كما هو موضح.

إليك تشريح الأعصاب الحوضية اليمنى واليسرى. بعد ذلك، اقطع الارتفاق العاني واقطع المفاصل الحرقفية (acetabular joints) اليمنى واليسرى. ثم قم بإزالة عظم الحرقفة. وبعد إزالة عظم الحرقفة، قم بتشريح الجزء القاصي من المستقيم والقولون مع العصب المتصل به حتى يتحرر.

العصب الملحق من العضلة والأنسجة الضامة المحيطة. العصب عرضة للتلف الميكانيكي. لقد قمنا بتحريره من الأنسجة المحيطة به، لذا يجب توخي عناية خاصة لتجنب شد العصب أو الضغط عليه.

بعد ذلك، انقل القولون والمستقيم مع العصب المتصل به إلى غرفة الأنسجة. افتح القولون والمستقيم طولياً على طول الحافة المضادة للمساريقا ووضع الجانب المخاطي للقولون والمستقيم للأعلى. ثم مدّ العصب إلى مقصورة التسجيل، المتصلة بمقصورة الحمام عبر فتحة صغيرة وبوابة.

ضع الجذع العصبي على مرآة زجاجية صغيرة. تتميز المرآة بأنها محبة للماء، مما سيجعل العصب يلتصق بها. الآن، وبجوار حجرة التسجيل، ثبت الحافة المساريقية للمستقيم باستخدام الدبابيس.

الآن، قم بإشباع حجرة الحمام بمحلول Creb المؤكسج الدافئ، واملأ حجرة التسجيل بالزيت المعدني لإتمام عملية الإعداد. قم بتثبيت الطول المقابل للمساريق من القولون والمستقيم على مجموعة من الخطاطيف المتصلة بمشغل القوة تحت المجهر الستيريو بتكبير عالٍ. قم بإزالة غمد العصب بعناية من عصب الضفيرة الحوضية أو القطنية المعزول باستخدام ملقط دقيق.

قم بتجزئة الجذع العصبي إلى خمسة إلى ثمانية حزم عصبية، بحيث يكون سمك كل منها حوالي 100 ميكرون. الآن، ضع القطب المرجعي بحيث يلامس محلول Krebs في حجرة الأنسجة. ثم قم بوضع الحزم العصبية الفردية بالتتابع على قطب التسجيل لاستثارة جهود الفعل من الجهاز العصبي المعوي القولوني والمستقيمي (colorectal ens).

امسح سطح القولون والمستقيم برفق باستخدام فرشاة رسم ناعمة، وذلك لتحديد الحزمة العصبية أو الحزم العصبية التي تغذي القولون. الآن، وباستخدام طرفي إبرتين قياس 30، قم بتقسيم الحزمة العصبية أكثر إلى خيوط بسمك 10 micron، ثم ضع أحد هذه الخيوط على قطب التسجيل.

تتطلب هذه الخطوة مستوى عالٍ من التنسيق بين العين واليد والبراعة اليدوية. ومن ثم، ولإثارة النهايات العصبية الواردة كهربائياً، يتم وضع القطب متحد المركز ذو الطرف المستدير بشكل عمودي على السطح المخاطي والتحفيز بكثافة فوق العتبة. ويؤدي ذلك إلى انتشار التيار على نصف قطر يبلغ 2 millimeter.

للعثور على النهايات المستقبلة، حرك القطب الكهربائي بشكل منهجي في خطوات قدرها 1.5 millimeter على طول وعرض المستقيم (rectum) المفلطح. عند تحفيز نهاية واردة، اضبط موضع القطب وكثافة التحفيز لتحديد المجال المستقبِل الذي يتطلب أقل كثافة تحفيز للاستجابة. إذا كانت عتبة التحفيز أكبر من ثلاثة milliamps، يتم استبعاد تلك النهاية العصبية والانتقال لدراسة ليفة عصبية أخرى.

قم الآن بحساب سرعة التوصيل من خلال المسافة بين القطب المحفز في المجال الاستقبالي وموقع التسجيل، ومن تأخر التوصيل بين أثر التحفيز وبدايات جهد الفعل. بعد تحديد المجال الاستقبالي عن طريق التحفيز الكهربائي، قم بتطبيق ثلاثة محفزات ميكانيكية. أولاً، قم بتطبيق تحفيز استكشافي عن طريق الضغط بطرف شعيرة "فون فراي" (von fray) معايرة، مثل شعيرة النايلون أحادية الخيط، بشكل عمودي تجاه المجال الاستقبالي على القولون والمستقيم المسطح.

استخدم خيوطاً أحادية الليف تولد قوة مقدارها 0.4 غرام وقوة مقدارها غرام واحد. ثانياً، قم بإحداث تحفيز بالمسح عن طريق مسح مخاطية المستقيم والقولون بلطف باستخدام خيط نايلون دقيق يولد قوة مقدارها 10 ملليغرام لتوليد إجهاد قص سطحي صغير في المجال الاستقبالي. ثالثاً، قم بإجراء التمدد المحيطي باستخدام مشغل قوة يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر.

اجعلها تسلط قوة شد متدرجة في اتجاه محيطي على طول الحافة المضادة للمساريقا في القولون والمستقيم. الآن، صنف الجهاز العصبي المعوي (ENS) على أنه طبقة مصلية، أو مخاطية، أو عضلية، أو عضلية مخاطية، أو ألياف حسية غير حساسة ميكانيكيًا (MIAA)، وذلك بناءً على نتائج الاختبارات الثلاثة.

ابدأ بتسجيل الاستجابة المرجعية لمحفز ميكانيكي كما في القسم السابق، وذلك عن طريق جس ميكانيكي محيطي متدرج، أو تمديدي، أو عمودي لاختبار الحساسية الكيميائية. أولاً، قم بطلاء الحافة السفلية لقطعة من أنابيب النحاس أو الفولاذ المقاوم للصدأ بالفازلين وضعها فوق الحقل المستقبل في القولون والمستقيم. الآن، قم بسحب محلول Krebs من داخل الأنبوب واستبدل المحلول بـ 170 µL من محلول الاختبار.

اترك الأنبوب في موضعه لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق مع مراقبة الاستجابات في العصب الوارد. فور إزالة الأنبوب خلال أربع إلى ست دقائق، اختبر استجابة العصب الوارد للمحفز الميكانيكي نفسه المستخدم في استجابة الخط القاعدي. بعد مرور 15 دقيقة أو أكثر، يمكن اعتبار الكواشف قد غُسلت بالكامل.

ثم يتم تطبيق التحفيز الميكانيكي مرة أخرى. وللمقارنة مع النمل المرجعي، تم تحفيز عصب تم تشريحه لتحديد الحقل الاستقبالي. وقد تم تحديد الحقل الاستقبالي من خلال استجابة جهد الفعل باستخدام تأخير التوصيل لجهد الفعل.

بلغت سرعة التوصيل المحسوبة 0.43 متر في الثانية، وهي تقع تماماً ضمن نطاق ألياف C غير الميالينية. وبعد تحديد المجال الاستقبالي، تم سبره بشكل عمودي باستخدام خيوط أحادية الشعرة يدوية تشبه خيوط فون فراي (von fray)، كما تم تحفيزه بلمسات خفيفة باستخدام خيط نايلون رفيع محمول باليد. كما تم تقييم استجابات AFR للسبر بواسطة مشغل قوة يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر، يقوم بتسليط سلسلة من القوى الميكانيكية الموقوتة بدقة والقابلة للتكرار على الموقع نفسه من القولون والمستقيم.

وبالمثل، تم تطبيق تمدد محيطي للقولون والمستقيم باستخدام نفس جهد المشغل الميكانيكي. يمكن تمييز الاستجابات بناءً على ردود الفعل تجاه السبر والمسح، بينما تم استثارة استجابات التمدد من العصب الوارد الحساس للتمدد عن طريق ثلاثة تمددات محيطية متتالية تفصل بينها خمس دقائق. تم تحديد أعداد النبضات بدقة وعرضها كدوال استجابة للمحفز، مما أظهر قابلية عالية للتكرار، وكلاً من مقدار الاستجابة وعتبة الاستجابة.

تم تطبيق المواد الكيميائية التالية. حدث تنشيط مباشر للنهايات العصبية بعد تطبيق محلول حمضي عالي التوتر عقب تطبيق "حساء التهابي" على ليف عصبي صادر غير حساس ميكانيكياً. لم يحدث تنشيط للنهايات، ولكن ظهر اكتساب للحساسية الميكانيكية.

كما تم تحفيز عصب وارد حساس للتمدد ومستجيب للمنبهات الميكانيكية (meno sensitive) تجاه التمدد الميكانيكي للحقل الاستقبالي بعد تطبيق "الحساء الالتهابي". وبمجرد إتقان هذه العملية، يستغرق إكمال تشريح الأنسجة وتحقيق تسجيل لليف عصبي واحد عادةً من ثلاث إلى أربع ساعات. وتستغرق التجربة النموذجية يوماً كاملاً من البداية إلى النهاية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تدرك كيفية إزالة وحصاد القولون والمستقيم جراحياً مع الأعصاب المتصلة به.

بعد ذلك، ستتمكن من التسجيل من ألياف Ahern مفردة في إما العصب الحوضي أو العصب القطني الضفيري الذي يغذي القولون، وذلك باستخدام استراتيجية بحث كهربائية غير متحيزة. يجب أن تكون حينها قادراً على تحديد النهايات المستقبلة في المستقيم واختبار حساسيتها الميكانيكية وكذلك حساسيتها الكيميائية من خلال تطبيق المواد الكيميائية مباشرة على النهايات المستقبلة. يعد هذا التحضير تحضيراً قوياً يتيح لك دراسة الآليات المرضية الفسيولوجية بالإضافة إلى الأسئلة الفسيولوجية الأساسية في المنطقة القولونية المستقيمة.