Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

L'obiettivo generale del seguente esperimento è preparare e caratterizzare nanoparticelle di SD F1 Alpha Chias e solfato di destrano. La preparazione delle nanoparticelle avviene innanzitutto mescolando il fattore di reclutamento delle cellule staminali, il fattore derivato dalle cellule stromali uno alfa o S df uno alfa, con il solfato di destrano, consentendo il legame con il glicano carico negativamente. Come secondo passaggio, viene aggiunto al miscuglio l'ozan, un glicano carico positivamente, che forma un complesso polielettrolitico con il solfato di destrano.

Successivamente, viene aggiunto solfato di zinco per stabilizzare i complessi mediante ponti di zinco. La particella risultante presenta un nucleo denso circondato da uno strato esterno negativamente carico. Le particelle vengono quindi analizzate per determinarne la dimensione e il potenziale zeta, nonché il contenuto e l'attività di S df one alpha nelle nanoparticelle. Il principale vantaggio delle nanoparticelle glicano di SDF one alpha è che l'SDF one alpha incorporato è completamente attivo senza dover essere rilasciato dalle particelle.

Pertanto, le particelle potrebbero risultare utili come segnale stazionario di hermine nella terapia con cellule staminali. Per iniziare, preparare le soluzioni madri come descritto nel protocollo testuale e sterilizzarle mediante membrane filtranti da 0,22 micron. Valutare i livelli di endotossine nella soluzione preparata mediante saggio gel-clot con lisato di ameba ulu.

Assicurarsi che i livelli siano inferiori a 0,06 unità di endotossina per millilitro. Successivamente, aggiungere 0,18 millilitri di acqua ultrapura in un vial di vetro da 1,5 millilitri contenente un agitatore magnetico. Impostare la velocità di agitazione a 800 giri al minuto, quindi aggiungere 0,1 millilitri di solfato di destrano al 1% e agitare per due minuti.

Aggiungere 0,08 milligrammi di SD F1 alpha e mescolare per 20 minuti. Aggiungere goccia a goccia 0,33 millilitri di 0,1% tizen e mescolare per cinque minuti. Impostare la velocità di agitazione al massimo e aggiungere lentamente 0,1 millilitri di solfato di zinco mediante siringa a tenuta stagna.

Riportare la velocità di agitazione a 800 giri al minuto e agitare per 30 minuti. Successivamente aggiungere 0,4 millilitri di mannitolo al 15% e agitare dopo cinque minuti. Trasferire la miscela di reazione in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 16.000 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e utilizzare una pipetta per rimuovere l'ultima goccia di liquido. Aggiungere lentamente 0,2 millilitri di mannitolo al 5% e sospendere il pellet utilizzando una siringa da 0,5 millilitri con ago da 29 gauge. Quindi aggiungere un ulteriore millilitro di mannitolo al 5% prima della centrifugazione.

Una seconda volta a 16.000 GS per 15 minuti. Dopo aver ripetuto il processo di centrifugazione della sospensione di risospensione, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 0,2 millilitri di mannitolo al 5%. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta vengono analizzati rispettivamente mediante scattering dinamico della luce e scattering elettroforetico della luce.

Per iniziare, selezionare un'operazione dalla lista delle procedure operative standard (SOP), che contiene i parametri per la misurazione della dimensione delle particelle mediante scattering dinamico della luce. Come indicato nel protocollo testuale, diluire il campione di particelle alfa SD F1 con acqua. Successivamente, caricare 100 microlitri del campione in una cuvetta UV monouso Q Vet, ad esempio una Einor Q Vet.

Inserire il Q vet nel portacellula e attendere che la regolazione dell'intensità raggiunga il livello ottimale prima di iniziare l'acquisizione dei dati. Al termine della misurazione, registrare i risultati cumulativi di diametro e indice di polidispersità. Calcolare la media dei risultati ottenuti da ciascuna delle quattro letture ripetute e determinare la deviazione standard per la misurazione del potenziale zeta mediante diffusione della luce elettroforetica.

Caricare 500 microlitri del campione di particelle diluito dieci volte nella cella a flusso. Selezionare una procedura operativa dall'elenco SOP relativo al potenziale zeta, che contiene i parametri per la misurazione come indicato nel protocollo testuale. Registrare i risultati del potenziale zeta.

Quindi, calcolare la media dei risultati ottenuti da ciascuna delle cinque letture ripetute e determinare la deviazione standard. Riscaldare i campioni diluiti di SD F1 alfa libero e legato alle particelle nel buffer campione lalysato a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire due vorticosi durante il riscaldamento di 10 minuti per dissociare completamente le particelle; dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente per due minuti, centrifugare a 10.000 ×g per 0,5-1 minuto per far sedimentare il condensato, quindi vorticosare nuovamente per ottenere una miscelazione omogenea.

A questo punto, la soluzione campione dovrebbe essere limpida e priva di precipitato visibile. Successivamente, caricare 10 microlitri di campione per pozzetto su un gel di elettroforesi SDS-PAGE al 4-20%. Eseguire l'elettroforesi a 200 volt per 20 minuti prima di colorare il gel con la colorazione proteica kumasi blue.

Esaminare la densità della banda proteica di SD F1 alpha mediante un sistema di imaging molecolare e un software di analisi densitometrica. Calcolare la quantità di S DF one alpha nelle particelle confrontandola con una curva standard costruita utilizzando standard liberi di SDF one alpha per eseguire il saggio di rilascio in vitro. Mescolare le particelle di glicani di SD F1 alpha con soluzione salina fosfato docos priva di calcio e magnesio o DPBS in rapporto uno a uno. Dividere la sospensione di particelle in aliquote di 0,05 millilitri in provette da 1,5 millilitri.

Caricare i campioni fino al fondo delle provette. Evitare di introdurre bolle d'aria o di disturbare la superficie del liquido. Sigillare la parte superiore delle provette con paraform.

Quindi ruotare le provette a 37 gradi Celsius su un agitatore rotante per microprovette. Prelievarne aliquote dalle provette ai tempi stabiliti e centrifugare immediatamente i campioni a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Separare i soprannatanti e i pellet.

Quindi ricostituire il pellet con 0,05 millilitri di DPBS. Dopo aver raccolto tutti i campioni, analizzare i soprannatanti e i pellet su un gel SDS. Come in precedenza, questo saggio misura l'attività chemiotattica di S df.

Un'interazione alfa di S df una alfa con il suo recettore induce la migrazione della cellula verso il gradiente di SD F1 alfa. Per iniziare, diluire la forma libera o legata a particelle di SD F1 alfa con il buffer per migrazione in una diluizione seriale triplice fino alle concentrazioni finali indicate nel protocollo del testo. Aggiungere 0,6 millilitri della soluzione di SD F1 alfa diluita in una pozzetta della piastra a 24 pozzette per il controllo negativo.

Eseguire la stessa operazione anche per il buffer di migrazione, quindi aggiungere 0,57 millilitri di buffer di migrazione in una pozzetta per il controllo delle cellule in ingresso. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, posizionare un inserto per coltura cellulare permeabile, come un transwell, sopra la pozzetta inferiore e caricare 0,1 millilitri di cellule jerk hat nell'inserto del transwell.

Quindi caricare direttamente 0,03 millilitri di cellule nel controllo della cella di ingresso. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, rimuovere gli inserti per coltura cellulare.

Trasferire le cellule che hanno migrato nei pozzetti inferiori in un tubo di polistirene da quattro millilitri. Contare le cellule migrate mediante citometria a flusso. Infine, calcolare la migrazione come percentuale del numero iniziale di cellule, sottraendo i valori dei controlli negativi.

Qui viene mostrata l'analisi della misurazione della dimensione delle particelle di destrano solfato SD F1 alfa ozano. Il risultato CUMUL mostra un diametro idrodinamico delle particelle di 671 nanometri e una polidispersione pari a 0,24. Questa schermata mostra una delle cinque misurazioni ripetute del potenziale zeta delle particelle di destrano solfato SD F1 alfa ozano.

Il potenziale zeta è di meno 24,7 millivolt. La quantità di S df uno alfa nelle particelle nano di S df uno alfa solfato di destrano ozan viene stimata mediante elettroforesi su gel SDS. Qui è mostrato un gel SDS colorato con kumasi, caricato con standard di S dF1 alfa, nanoparticella controllo solfato di destrano kaizan e campioni di nanoparticelle di solfato di destrano S dF1 alfa kaizan.

Viene costruita una curva standard a partire dall'analisi della densità delle bande del campione standard SD F1 Alpha. Il calcolo della concentrazione a partire dalla curva standard indica che la concentrazione di S DF one alpha nel campione di nanoparticelle di SDF one alpha è di 0,03 milligrammi per millilitro. Per determinare il tasso di rilascio in vitro di S DF one alpha dalle nanoparticelle, la quantità di S DF one alpha rilasciata nel sopranatante e la quantità di SDF one alpha legata alle particelle nei pellet è stata determinata mediante colorazione con kumasi di un gel SDS seguita da analisi citometrica. L'attività di S DF one alpha legata alle particelle viene misurata mediante un saggio di migrazione e confrontata con quella di SDF one alpha libera, come mostrato qui.

La migrazione indotta da SDF-1α legato alle particelle è risultata uguale a quella indotta da SDF-1α libero a tutte le concentrazioni misurate. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la formulazione delle particelle di glicoproteine può essere modificata. A seconda dell'applicazione specifica, è possibile incorporare altre proteine e utilizzare diverse formulazioni per variare la dimensione delle particelle.

Speriamo che questo video abbia illustrato le tecniche di base per la preparazione della raccolta di nanoparticelle e successivamente per l'analisi funzionale della SDF-1α incorporata.