Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Aşağıdaki deneyin genel amacı, evcil hayvan görüntülemesi için Tet INE ve trans siklo oktin arasında bir biyo ortogonal reaksiyon kullanarak kanserli dokuyu önceden hedeflemektir. Bu, antikorun tümörde yavaşça biriktiği ve kandan temizlendiği bir aralık periyodunun ardından trans siklotin etiketli bir antikor ile tümör taşıyan bir fareye enjekte edilmesiyle elde edilir. Aynı hayvana bir tetra zine radyo ligandı enjekte edilir.

Radyo ligandı, tümörde TCO işaretli bir antikor ile tıklanır ve küçük bir molekül olduğu için kandan hızla temizlenir. Elde edilen küçük hayvan PET görüntülemesi, yüksek kontrast ve yüksek tümör / arka plan aktivite oranları ile tümörün net bir şekilde tanımlandığını gösterir. Bu tekniğin, doğrudan etiketlenmiş antikorlarla PET görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hastaya radyasyon dozunun sadece bir kısmını oluşturan yüksek kontrastlı görüntüler sağlamasıdır.

Bu tekniğin etkileri tedaviye doğru uzanır, çünkü ön hedefleme teknikleri tümörlere çok yüksek miktarda radyasyon verebilirken, aynı zamanda dozlar sağlıklı organlara ve sağlıklı dokulara çok düşük olacaktır. Bu tekniği laboratuvarımızda bir teknisyen olan Catherine Kaza ile birlikte göstereceğim. Sentez reaksiyonu, yedi miligram NH iki BN Notta'nın pH 8.1'de 600 mikrolitre 0.1 molar sodyum bikarbonat içinde çözülmesiyle başlar.

PH'ı kontrol edin ve gerekirse pH'ı 8.1'e ayarlamak için 0.1 molar sodyum karbonatın küçük alikotlarını kullanın. Daha sonra, bu çözeltiyi bir mikro santrifüj tüpünde 0.5 miligram TZ NHS'ye ekleyin. Bu reaksiyonun hafif çalkalama ile oda sıcaklığında yarım saat inkübe edilmesine izin verin.

TZ NHS stoğu yarım saat sonra DMF veya DMSO'da çözülebilir. 254 nanometrede kaydolacak olan reaktif olmayan NH iki BN notta'yı çıkarmak için ürünü ters faz C 18 HPLC ile saflaştırın. TZ NHS ve TZ BN Notta en iyi 525 nanometrede izlenir.

Numunenin alıkonma süresi ekipmana göre değişecektir, ancak 25 dakika boyunca sıfır ila 100 ila 100 ila sıfır aseton nitril ila su gradyanı ve analitik 4.6 x 250 milimetre C 18 sütunu kullanılarak, tutma süreleri üç bileşik için sırasıyla 16.5 15 ve 10 dakika olacaktır. Toplanan HPLC eent'i sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından tüpü opak folyo yağına sarın. Şimdi, donmuş tüpü liyofilize bir kaba yerleştirin ve gece boyunca bir liyofilizatör üzerine yerleştirin.

Tamamlanmış TZ bn no top öncüsünün saflığını doğrulamak için HPLC mobil fazını çıkarmak için proton NMR analitik HPLC ve/veya ESI kütle spektrometresi kullanın. Bu reaksiyona, ikinci bir mikro santrifüj tüpünde bir mikro santrifüj tüpünde DMF'de 2.7 milimolar bir T-C-O-N-H-S çözeltisi hazırlayarak başlayın. Bir mililitre PBS pH 7.4'te mililitre başına iki miligram HUA 33 çözeltisini onarın.

Daha sonra küçük 0.1 molar sodyum karbonat ilaveleri kullanarak, çözeltinin pH'ını 8.8 ile 9.0 arasında ayarlayın, ancak daha yüksek değil. Daha sonra, aktive edilmiş esterin sekiz molar eşdeğerine karşılık gelen bir T-C-O-N-H-S hacmi ekleyin. Çözeltiyi birkaç ters çevirme ile yavaşça karıştırın ve folyoya sarın.

Daha sonra tüpü, hafif çalkalama ile yaklaşık bir saat oda sıcaklığında inkübe edecek şekilde ayarlayın. Bir saat sonra, immünokonjugatı reaksiyondan arındırmak için önceden paketlenmiş tek kullanımlık bir boyut dışlama tuzdan arındırma sütunu kullanın. Kolona bir mililitre reaksiyon karışımı ekleyin ve ardından 1.5 mililitre% 0.9 steril salin ekleyin.

Ardından, insanlaştırılmış HUA 33 TCO ürününü iki mililitre% 0.9 salin ile elüte edin. Ürünün konsantrasyonunu bir UV vis spektrometresi ile ölçün. Konsantrasyon istenenden düşükse, ürünü 50.000 moleküler ağırlıklı santrifüj filtre ile konsantre edin.

Bir mikro santrifüj tüpünde mililitre başına 0.5 miligram TZ BN notta çözeltisi hazırlayarak başlayın. İkinci bir mikro santrifüj tüpünde, pH 5.5'te 400 mikrolitre 0.2 molar amonyum asetat tamponuna 10 mikrolitre hazırlanan TZ BN Notta çözeltisi ekleyin. Yaklaşan adımların her birinden önce ve sonra numunenizin radyoaktivite miktarını ölçtüğünüzden ve kaydettiğinizden emin olun.

Bu, radyo kimyasal verimlerinin doğru bir şekilde hesaplanması ve kayıt tutulması için gereklidir. Şimdi, TZ BN Notta çözeltisine 2000 mikro küri bakır 64 ekleyin. Bu karışımı oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 10 dakika inkübe edin.

Ürünü saflaştırmak için ters faz C 18 HPLC kullanın, ürünleri beş ila 95 ila 95 ila beş aseton nitril kullanarak %0,1 TFA ile 15 dakika boyunca su gradyanına seyreltin. tz, BN nota etiketli radyo 9.8 dakikada elüte olurken, serbest bakır 64, HPLC eantını çıkarmak için döner bir buharlaştırıcı kullandıktan iki ila dört dakika sonra çözücü cephesi ile elüte olur, radyo etiketli ürünü %0.9 steril tuzlu su içinde çözün, ardından ürünü mümkün olan en kısa sürede kullanmaya devam edin. Bu prosedür, hazırlanan HEA 33 TCO çözeltisinin bir Eloqua'sının% 0.9 steril salin içinde mililitre başına 0.5 miligram konsantrasyona seyreltilmesiyle başlar.

Daha sonra 200 mikrolitre solüsyonu ksenogreft taşıyan farenin kuyruk damarına enjekte edin. İnsanlaştırılmış bir 33 TCO'nun 24 saat boyunca tümörde dolaşmasına ve birikmesine izin verin. 24 saat sonra, TZ BN Notta etiketli bakır 64'ü %0,9 steril tuzlu su içinde mililitre başına 1,5 MILLICURIES konsantrasyonunda onarın.

Daha sonra, hazırlanan radyoligand çözeltisinin 200 mikrolitresini istenen zamanda fareye uygulamak için bir kuyruk damarı enjeksiyonu kullanın. Fareyi uyuşturun ve küçük bir hayvan evcil hayvan tarayıcısının yatağına yerleştirin. Anestezi, bir burun konisi yoluyla uygulanarak sürdürülmeli ve anestezi durumu bir ayak parmağı tutamağı kullanılarak doğrulanmalıdır.

Ayrıca kurumayı önlemek için ince bir tabaka oftalmik merhem sürün. Şimdi, 350 ila 700 kilo elektron voltunda 60 milyon çakışan olayla statik bir tarama kullanarak evcil hayvan verilerini elde edin ve görüntülemeden sonra altı nanosaniyelik bir tesadüf zamanlamasıyla, farenin bilincini geri kazanmasını bekleyin ve potansiyel olarak diğer farelerle birlikte kafesine geri dönün. SW 1222 kolorektal kanseri eksprese eden 33 antijen taşıyan timik çıplak fareler.

Ksenogreftler tarif edilen protokol kullanılarak incelendi. Hem akut biyodağılım hem de PET görüntüleme deneyleri, ön hedefleme stratejisinin kolorektal kanser ksenogreftini mükemmel görüntü kontrastı ve yüksek tümör / arka plan aktivite oranları ile tanımlayabildiğini ortaya koymaktadır. Birkaç saat boyunca, radyo ligandı dışkıda temizlenir ve tümörün arka plan aktivite oranları oldukça yüksek hale gelir.

Bu ön hedefleme yaklaşımındaki bazı değişkenler, herhangi bir görüntüleme stratejisinde olduğu gibi optimizasyon gerektiriyordu. 100 mikrogram yerine 300 mikrogram antikor TCO konjugatının uygulanması, farenin kalbinde görülebilen radyoaktivitenin artmasına ve aralığın 24 saatten 12 saate düşmesine neden oldu. Her iki durumda da, tıklama reaksiyonu hala tümörde meydana geldi ve erken zaman noktalarında tümöral tutulum ile oldukça net bir şekilde gösterildi.

Bununla birlikte, tıklama reaksiyonu kanda da açıkça meydana gelmektedir ve bu istenmeyen bir durumdur. Bu prosedür denenirken tüm ön hedefleme değişkenlerinin hassas bir dengesi sağlanmalıdır. TCO İmmünokonjugatının kütlesinin yanı sıra enjeksiyonlar arasındaki zaman aralığının optimize edilmesi çok önemlidir.

Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve deney sırasında uygun KKD giymek ve radyasyonun her zaman korunduğundan emin olmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.