Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hefezellen zu verwenden, um die biologischen Prozesse zu finden, auf die eine Chemikalie von Interesse abzielt. Dies wird erreicht, indem zunächst das Dosis-Wirkungs-Profil einer Chemikalie für Hefe bestimmt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine vollständige Sammlung von Hefe-Gen-Knockout-Stämmen auf einer subletalen Dosis einer Chemikalie und auf einer Kontrollplatte zu züchten.

Als nächstes werden Hefemutanten identifiziert, die überempfindlich auf die Chemikalie reagieren. Diese Liste wird bioinformatisch analysiert, um alle Gene aufzudecken, die zur Verträglichkeit der Chemikalie erforderlich sind. Der letzte Schritt besteht darin, ein biologisches Replikat des Experiments mit geringem Durchsatz durchzuführen.

Dies bestätigt alle gefundenen chemischen Geninteraktionen. Letztendlich wird diese chemische genetische Screening-Methode mit hohem Durchsatz verwendet, um zu zeigen, welche Genprodukte und biologischen Signalwege verwendet werden, um die interessierende Chemikalie zu tolerieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem kompetitiven Wachstum von barcodierten Mutanten in Flüssigkulturen, besteht darin, dass keine molekularbiologischen Techniken erforderlich sind.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der chemischen Biologie zu beantworten, etwa wie ein neuartiges kleines Molekül das Wachstum eukaryotischer Zellen hemmen kann. Bereiten Sie zunächst eine Hefekultur über Nacht vor, indem Sie BY 4 7 4 1 Zellen auf einer A-Y-E-P-D-Platte ausstreift und 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren oder bis sich sichtbare Kolonien bilden. Wenn die Völker bereit sind.

Bereiten Sie über Nacht Flüssigkulturen vor, indem Sie eine einzelne Kolonie auswählen und fünf Milliliter YEPD-Flüssigmedium in ein steriles Gefäß impfen. Dann über Nacht bei 30 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation oder Schütteln inkubieren. Bereiten Sie anschließend feste Agarmedien vor, die verschiedene Dosen der zu testenden Chemikalie enthalten.

Um dies zu tun. Zuerst werden mehrere Stammlösungen der interessierenden Chemikalie mit dem 100-fachen der Endkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt. Dann aliquotieren Sie für jede zu prüfende Konzentration drei Milliliter geschmolzenen YEPD-Agar in mehrere sterile Kulturröhrchen.

Die Röhrchen mit dem Agar in ein 55 Grad Celsius heißes Wasserbad legen, um eine Verfestigung des Agars zu verhindern. Nun, für jede Konzentration der Chemikalie, die bei 13 getestet werden soll, weiße Freisetzung der 100-fachen Verbindung an ein Aliquot geschmolzenen Agar tex, das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden mischen und dann einen Milliliter aus jedem Röhrchen in doppelte Vertiefungen in einer 12-Welt-Platte pipettieren lassen, lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Am nächsten Tag beimpfen Sie 10 Milliliter YEPD-Flüssigmedium mit zwei Mikrolitern der gesättigten Nachthefekultur.

Pipettieren Sie dann 25 Mikroliter dieser Kultur auf die agarhaltige Chemikalie in den Vertiefungen der 12-Wal-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder einem sterilen Stab. Lassen Sie die Platte unter einer Flamme trocknen und inkubieren Sie die Platte dann 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Bewerten Sie nach Ablauf der Inkubationszeit die Gesamtzahl und Größe der Kolonien in den Vertiefungen.

Identifizieren Sie eine subletale Konzentration der Verbindung, die das Wachstum nicht um mehr als 10 bis 15 % hemmt, um sie im Sieb zu verwenden. Die Deletionsmutantenrate wird bei einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte gehalten, indem auf 16 YEPD-Agarplatten repliziert wird, die 200 Mikroliter pro Milliliter G vier 18 enthalten. Verwendung eines mikrobiellen Arraying-Robotersystems oder manueller Pinning-Tools alle drei Monate.

Lagern Sie die Platten bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie dann 250 Milliliter YEPD-Agarmedien mit der gleichen Konzentration von G, vier 18- oder fünf Agarplatten vor und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur auf einer ebenen, ebenen Fläche abkühlen. Nehmen Sie die Platten mit der Deletionsmutantensammlung bei vier Grad Celsius aus der Lagerung und lassen Sie die Platten auf Raumtemperatur kommen.

Verwenden Sie ein Feinfühltuch, um Kondenswasser zu entfernen, das sich auf dem Deckel jeder Platte gebildet hat, um zu verhindern, dass sich Wassertröpfchen auf dem Array ablagern und die Array-Mutanten kreuzen. Lassen Sie den mikrobiellen Array-Pinning-Roboter das Deletionsmutanten-Array von einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte auf 16 Petrischalen auf 1.536 Kolonien pro Platte auf vier Petrischalen kondensieren. Nachdem Sie das Array über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, untersuchen Sie das Array, um einen gleichmäßigen Transfer der Kolonien von den Quellplatten sicherzustellen.

Es werden mehrere leere Positionen in das Array integriert, die als Anhaltspunkt dafür dienen, dass das Deletionsmutanten-Array korrekt komprimiert wurde. Dies sind die Quellplatten, die für die Replikation auf Medien verwendet werden, die Ihre interessante Verbindung enthalten. Eine einzelne Quellplatte kann für mehrere Pinnings verwendet werden.

Außerdem verfügen viele Roboter über Offset-Funktionen, die es ermöglichen, jedes Mal eine ähnliche Anzahl von Hefen zu übertragen. Um die Reparatur des Replik-Plattendeletions-Mutanten-Arrays einzurichten, werden nur 700 Milliliter Kontrollvehikel und experimenteller YEPD-Agar mit der interessierenden Chemikalie benötigt. Dies reicht aus, um den Assay in dreifacher Ausführung durchzuführen.

Gießen Sie die Platten mit dem Kontroll- und Versuchsagar. Fügen Sie 50 Milliliter zu jeder Platte hinzu. Lassen Sie die Platten über Nacht auf einer ebenen, ebenen Fläche bei Raumtemperatur abkühlen und verwenden Sie den Roboter, um eine Platte zu replizieren.

Das Doppelmutanten-Array wird auf drei Sätze von Platten mit Chemikalien in der experimentell bestimmten Konzentration sowie auf Rücksetzungen von Platten mit der Fahrzeugsteuerung geimpft. Inkubieren Sie die Platten auf der Tischplatte bei Raumtemperatur für insgesamt 24 bis 48 Stunden Bild. Die Platten sind 24 und 48 Stunden inkubiert, indem der Deckel entfernt und mit der Vorderseite nach unten auf einen Flachbettscanner gelegt wird.

Nehmen Sie Bilder mit einer Auflösung von mindestens 300 DPI auf. Alternativ können Sie eine Digitalkamera verwenden, um Bilder aufzunehmen. Legen Sie in diesem Fall die Teller mit der Vorderseite nach oben auf einen dunklen Hintergrund und entfernen Sie die Deckel, um das Bild zu erhalten.

Führen Sie dann die Quantifizierung und den Vergleich der Array-Koloniegrößen mit einem von mehreren Open-Source-Programmen durch, einschließlich Kugel-SGA-Tools und Siebfräse. In diesem Stadium werden mehrere Hefe-Deletionsmutanten als überempfindlich gegenüber der interessierenden Chemikalie eingestuft und die gewünschten überempfindlichen Mutanten aus der Hefe-Deletionssammlung auf YEPD übertragen. Ager mit 200 Mikrogramm pro Mikroliter G vier 18 inkubieren bei 30 Grad Celsius, bis sich Kolonien bilden.

Nach der Verifizierung des Genotyps des Stammes durch diagnostische PCR und Agel-Elektrophorese inokulieren fünf Milliliter der YPD-Flüssigkeit mit jedem Stamm und inkubieren über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Rotation oder Schütteln. Messen Sie den OD 600 jeder Kultur und verdünnen Sie jeden Stamm auf einen OD 600 von eins in sterilem destilliertem Wasser. Dies sind nun die normalisierten Hefekulturen.

Als nächstes werden 100 Mikroliter des normalisierten Wildtyps durch 4 7 4 1 Hefekulturen an die Vertiefung A einer von einer 96-Well-Platte abgegeben und 100 Mikroliter von bis zu sieben zusätzlichen Stämmen in die Vertiefungen abgegeben, B eins bis H eins. Geben Sie als Nächstes 90 Mikroliter steriles Wasser in Brunnen ab, A zwei bis H zwei bis a sechs bis H sechs. Bereiten Sie schließlich eine Serie von einer bis 10 Verdünnungen normalisierter G-Skulpturen vor.

Beginnen Sie mit dem seriellen Pipettieren von 10 Mikrolitern der ersten Säule bis zur zweiten Säule mit einer Mehrkanalpipette und fahren Sie mit der 96-Well-Platte fort, bis sechs Verdünnungen vorgenommen wurden. Verwenden Sie dann die Mehrkanalpipette auf zwei bis fünf Mikroliter der verdünnten Hefekulturen in einem Gitter auf YEP D's, festen Medien, die Chemikalien und Vehikel enthalten. Inkubieren Sie die Platten nach der Inkubation 24 bis 48 Stunden lang bei der entsprechenden Temperatur.

Untersuchen Sie die Platten und vergleichen Sie die Empfindlichkeit ausgewählter Mutanten gegenüber Chemikalien im Vergleich zu den Kontrollbildfolien BY 47 41 nach 24 und 48 Stunden. Wie zuvor zeigen die folgenden Bilder die Ergebnisse des Verfahrens zur Bestimmung der subin-inhibitorischen Konzentration der Chemikalie. Das erste Bild zeigt das Wachstum einer gesättigten BY 4 7 4 1 Kultur, die um eins bis 5.000 verdünnt und mit steigenden Konzentrationen von fünf Fluoruracil plattiert wurde.

Die Konzentration von 10 Mikromolaren wird als sub-in-inhibitorische Dosis gewählt. Dieses Bild zeigt die Wachstumskurve von BY 4 7 41 Zellen in flüssigen Medien, die fünf Fluro-Uracil enthalten. Ungefähr viermal wurden 10 to die vier Zellen in dreifacher Ausfertigung abgeschieden und steigende Konzentrationen von fünf Fluor, Uracil und optische Dichten wurden alle 10 Minuten für 22 Stunden gemessen.

Auch hier ist zu erkennen, dass die Dosis von 10 Mikromolaren die subin-inhibitorische Dosis ist. Die nächsten Bilder zeigen die Ergebnisse einer chemischen Genetik grün von fünf Fluor-Uracil. Hier ist ein S sachar visier deletion mutant array repliziert, das auf YPD-Agar repliziert wurde und rechts 10 mikromolare fünf Fluor Uracil und links eine DMSO-Kontrolle enthält.

Diese Grafik zeigt die Ergebnisse der chemischen Genetik grün, das relative Wachstum der Mutanten auf 10 Mikromolaren. Fünf Fluor-Uracil sind im Vergleich zur DMSO-Kontrolle hier nach einer Strahlposition geordnet. Das relative Wachstum der Mutanten auf Uracil mit 10 Mikromolaren und fünf Floren im Vergleich zur DMSO-Kontrolle ist nach dem Verhältnis der Koloniegröße geordnet.

In beiden Diagrammen ist ein Verhältnisschwellenwert von weniger als 0,8 angegeben. Dieses letzte Bild zeigt die Ergebnisse von drei Validierungsassays. Serielle Verdünnungen mehrerer isolierter mutierter Stämme wurden auf der DMSO-Kontrolle auf der linken Seite, 10 Mikromolaren, fünf Fluor-UIL in der Mitte und 0,015 % Methylmethansulfonat auf der rechten Seite gezüchtet.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, dass Sie auch mit einer zuverlässigen Kopie des Deletionsmutanten-Arrays arbeiten, um alle Ergebnisse mit einer unabhängigen Methodik wie Hefe-Spotting-Assays oder Hefe-Tetraden-Dissektion zu validieren. Diese Technik bietet Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Forschung an kleinen Molekülen ein effizientes Mittel, um die Wirkungsweise einer Verbindung mit Ansätzen auf Systemebene in knospenden Hefen zu untersuchen.