Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la distribuzione dei metalli in una popolazione di cellule. Ciò si ottiene preparando prima finestre sterili in nitruro di silicone e successivamente coltivando cellule su tali finestre. Quindi le cellule vengono fissate, risciacquate in un tampone compatibile ed essiccate.

Il passaggio finale consiste nell'visualizzare le celle sulla linea del fascio. In definitiva, la microscopia a fluorescenza a raggi X viene utilizzata per mostrare la distribuzione dei metalli nella cellula. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché le finestre sono molto fragili.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la crescita delle cellule sulle finestre con un'aggregazione cellulare minima, così come le fasi di risciacquo sono complicate perché le cellule non aderiscono bene ai substrati fluorescenti a raggi X. Il primo compito consiste nell'isolare la finestra. Innanzitutto, usando uno stereoscopio, assicurati che un paio di pinzette a punta fine inversa siano allineate dritte e pulite.

Quindi, aprire leggermente la capsula contenente la finestra. Stringere un'estremità contenente la finestra mentre si ruota l'altra estremità. Non schiacciare la finestra stessa.

Quindi afferrare con cura il telaio con le pinzette mentre si stringe delicatamente la capsula vicino all'estremità aperta. Applicare pressione per allargare la capsula nel punto in cui dovrebbero uscire i bordi della finestra e rimuovere la finestra. Ora prepara del nastro adesivo.

Metti un pezzo di nastro adesivo su un vetrino pulito e taglia una striscia di nastro adesivo da un quarto di pollice dal lato lungo del vetrino. Quindi posizionare un vetrino di nastro adesivo sul lato corto e rimuovere la sezione di nastro con le pinzette. Applicare il nastro adesivo sul bordo della finestra con una forza sufficiente per farlo aderire e facendo attenzione a non coprire l'apertura della finestra con del nastro adesivo.

Usando le pinzette, posiziona la finestra sul fondo di un piatto coltivato e premi saldamente il nastro adesivo sul piatto. Quindi ripeti il processo per fissare con del nastro adesivo l'altro lato della finestra. Il piatto dovrebbe ora essere sterilizzato con UV per un'ora.

Questo protocollo richiede che le cellule vengano coltivate al 50-70% di confluenza su piastre contenenti la finestra attaccata. Eventuali colorazioni vitali applicate e le cellule devono essere visualizzate prima di procedere con il fissaggio. Rimuovere il supporto mediante aspirazione delicata, inclinando la piastra con un angolo di 45 gradi.

Quindi sciacquare delicatamente la pirofila con DPBS. Sostituire immediatamente il liquido rimosso aggiungendo delicatamente il 4% fresco di P-F-A-P-B-S con un angolo di 45 gradi e verso il lato del piatto. Rilassare lentamente l'angolo per consentire alla soluzione fissativa di coprire le finestre.

Tenere il fissativo sulle cellule per 20 minuti dopo il fissaggio. Rimuovere il liquido mediante aspirazione delicata. Usando la stessa tecnica delicata di prima, sostituisci delicatamente il liquido con i tubi.

Soluzione di saccarosio. La tecnica per rimuovere e sostituire il liquido è fondamentale perché le cellule non aderiscono bene ai substrati. È qui che molti principianti hanno visto fallire i loro esperimenti.

Quindi sostituire delicatamente la soluzione di saccarosio per tubi per lavare via eventuali residui di fissante. Ora, rimuovi la finestra con una pinzetta del nastro. Se le finestre si staccano dal nastro, fai galleggiare la finestra sulla superficie con la soluzione aggiunta e rimuovila con le pinzette inverse.

Ora, senza toccare la finestra, tamponare accuratamente qualsiasi soluzione dal bordo. Inoltre, tampona l'area rientrante utilizzando una piega arrotondata di tessuto. L'obiettivo è quello di avere la minor cristallizzazione possibile di sale o tampone sulla finestra.

Infine, posiziona con cura la finestra sul tappetino a griglia appoggiato su un bordo contro la cresta del tappetino. La finestra dovrebbe toccare il meno possibile il tappetino. Una volta asciugato il campione, si verifica la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico.

Dopo aver confermato che le celle sono sui finestrini, imballare i finestrini per il trasporto alla linea del fascio di sincrotrone. Fissare delicatamente le finestre su due bordi a uno scivolo di vetro. Quindi fissare il vetrino a una capsula di Petri di plastica con del nastro adesivo e chiudere la capsula di Petri con del nastro adesivo.

Fino a questo punto, i passaggi possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio tipico, i passaggi successivi sarebbero meglio eseguiti su una linea di luce di sincrotrone. Il disimballaggio della finestra inizia con la rimozione delicata del nastro con una pinzetta. Quindi la finestra viene trasferita su un supporto in alluminio fornito dai collaboratori della linea di luce al sincrotrone.

Fissa la finestra con uno strato sottile e uniforme di smalto per unghie lungo il bordo. A questo punto, inserire il supporto in alluminio in un supporto cinematico. Fissare il supporto su una staffa collegata al tavolino motorizzato che si trova all'interno della camera del campione e sulla linea di luce del microscopio a raggi X.

Dopo essere usciti dalla linea di piombo all'area dello strumento del microscopio a raggi X, impostare la scansione utilizzando un software specifico per la linea di luce. Scegliere l'area appropriata del campione da scansionare mentre si visualizza la posizione del raggio di raggi X sul campione. Utilizzando una telecamera dotata di un video a pelo incrociato e preallineata con una telecamera scintillante a valle, ulteriori dettagli sono forniti nel protocollo di testo.

Utilizzando queste tecniche nelle immagini a raggi X di un campione, è possibile vedere che c'è una variazione negli elementi presenti che indica che la fissazione preserva questi aspetti delle cellule, come con questa cellula umana HSY a cinque Y. Tuttavia, se il tampone rimane presente durante l'essiccazione, l'estesa formazione di cristalli crea danni strutturali alle cellule e interferisce con la raccolta degli spettri fluorescenti a raggi X. Questo può essere visto in una cella RET B 1 0 3 mal elaborata.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una cellula aderente mediante fissazione chimica per l'imaging a fluorescenza a raggi X. Non dimenticare che lavorare con formaldeide e materiali biologici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come DPI adeguati e seguire le linee guida istituzionali.