Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Bu prosedürün genel amacı, gen susturma çalışmaları ve sivrisinek larvaları için tussin enterferansiyeli, RNA nanopartikülleri tasarlamak ve kullanmaktır. Bu, önce kitin ve enterferans yapan RNA'nın birleştirilmesiyle tussin enterferans yapan RNA nanopartiküllerinin hazırlanması, ardından ısıtma girdaplanması ve santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Bir sonraki hedef, nanopartikülleri larva yemi ve aros ile karıştırarak gıda ve nanopartikül içeren jel peletleri hazırlamaktır.

Nanopartikül gıda, sivrisinek larvalarına beslenir ve pelet üzerinde beslenen larvalar, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile gen susturmanın doğrulanmasını takiben nihai olarak gözlemlenir. Veya C'de iki hibridizasyon testi. Fonksiyon kaybı fenotipleri incelenebilir.

Bu yöntem, vektör sivrisinek araştırma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, koku alma sisteminin, beyin orta bağırsağının ve vektör öneme sahip diğer dokuların gelişimi sırasında genlerin işlevlerini incelemek için kullandık. Bu tekniğin temel avantajları, yüksek verim, nispeten ucuz ve organizma için, daha yüksek düzeyde beceri gerektiren ve sahada uygulanamayan mikroenjeksiyon yoluyla enterferans yapan RNA'nın verilmesinden daha az stresli olmasıdır.

Doktora sonrası araştırmacı Ava Maur ile birlikte, teknisyen Ping Lee prosedürü gösterecek: % 0.02'lik bir çalışma çözeltisi yapmak için 0.1 molar sodyum asetat tamponunda tussin'i çözün. Kullanmadan önce çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Daha sonra çözünmüş çift sarmallı RNA veya küçük enterferans yapan RNA, her ikisi de bundan sonra 50 mikrolitre deiyonize suda enterferans yapan RNA olarak anılacaktır.

100 mikrolitre 50 milimolar sodyum sülfat başına 100 mikrolitre 32 mikrogram nükleik asit çözeltisi yapın. Daha sonra, enterferans yapan RNA çözeltisine 100 mikrolitre tussin çözeltisi ekleyin. Karışımı bir su banyosunda 55 santigrat derecede bir dakika ısıtın.

100 mikrolitre Tustin çözeltisine 100 mikrolitre 50 milimolar sodyum sülfat ekleyerek bir kontrol ayarlayın ve ısıttıktan sonra aynı prosedürü izleyin. Nanopartikül santrifüj oluşumunu kolaylaştırmak için çözeltileri oda sıcaklığında yüksek hızlı girdaplama ile hemen 30 saniye karıştırın, karışım oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13.000 G'de pişirildikten sonra uygulama peleti görünür olmalıdır. Supinatı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın, peleti kullanmadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika kurutun.

UV spektrumları fotometrisi kullanarak sivrisinek yemi hazırlamak için, SNAT'taki enterferans yapan RNA'nın konsantrasyonunu, snat'ta kalan toplam enterferans yapan RNA miktarını hesaplamak için kontrolden gelen S süpernatantını boş olarak kullanarak ölçün. Enterferans yapan RNA'nın başlangıç miktarları ile süpernatantlarda kalan miktarlar arasındaki farkı, enterferans yapan RNA'nın yüzdesini hesaplamak ve nanopartiküllerde hapsolmuş olarak kullanın. Bu yükleme verimliliği normalde% 90'ın üzerindedir, daha fazla nanopartikül gerekiyorsa aynı prosedürü tekrarlayın.

Kullanımdan önce parçacıkların soğuk depolanmasının etkisi değerlendirilmediği için kurutulmuş nanopartikülleri hemen kullanın. Önce sivrisinek yemini formüle etmek için, deiyonize suda %2'lik bir tarımsal çözelti hazırlayın ve aroları eritin. Erimiş agro solüsyonunu kullanmadan önce 55 santigrat derece su banyosunda tutun.

Daha sonra balık yemi pullarını ve kuru mayayı bir ila iki oranında karıştırın. Karışımı bir havan ve havaneli ile küçük parçacıklar halinde öğütün. Öğütülmüş yiyecekler kahverengimsi renktedir.

1.5 mililitrelik bir tüpte, bir kürdan kullanarak kuru nanopartiküllerle altı miligram öğütülmüş yiyecek yapın. Daha sonra gıda nanopartikül karışımına 30 mikrolitre% 2 prem eritilmiş agros jel çözeltisi ekleyin. Bir kürdan veya pipet ucu kullanarak hemen ve iyice karıştırın.

Yiyecek ve nanopartiküller içeren jel artık sivrisinek larvalarını beslemeye hazırdır, anomalileri gambi sivrisinek larvalarını beslemek için. Bir kürdan kullanarak 1,5 mililitrelik tüpten tek bir jel peletini çıkarın ve temiz bir tıraş bıçağı veya kürdan kullanarak dört eşit dilime kesin. Daha sonra yıldız larvalarının 23'ünü 100 mililitre deiyonize su içeren bir Petri kabına aktarın.

Sivrisinek larvalarını bir dilim jel peleti ekleyerek besleyin. Son olarak, Petri kabı başına küçük parçalar halinde doğranmış. Dört gün boyunca günde bir kez, larvaların pelet üzerinde beslendiğini gözlemlediğinizden emin olun, bu da boyut olarak önemli ölçüde küçültülmeli veya ertesi gün tamamen yok olmalıdır.

Sivrisinekler larvalarda dördüncü çeyreğin sonlarına kadar gelişecektir. Deney sırasında gözle görülür fenotipik değişiklikleri kaydedin. Seksenlerin GTI sivrisinek larvalarını beslemek için dört günlük sürenin sonunda metin protokolünde tartışıldığı gibi transkript seviyelerini ve diğer fenotipik değişiklikleri inceleyin.

Jel peletini daha önce olduğu gibi temiz bir tıraş bıçağı veya kürdan kullanarak dört eşit dilime kesin. Daha sonra yumurtadan çıktıktan 24 saat sonra senkronize olarak 50 saat yerleştirin. İlk olarak yıldız larvalarında bir Petri kabına.

Yaklaşık 40 mililitre deiyonize suda. Larvaları günde dört saat boyunca Petri kabı başına bir dilim besleyin. Yine dilim ince ince küçük parçalar halinde doğranmalıdır.

Daha sonra larvaları, günün geri kalanında iki ila bir öğütülmüş balık, yem, pul ve kuru mayadan oluşan normal larva diyetine geri aktarın. Dört larva instarı boyunca prosedürü günlük olarak tekrarlayın. İstenen gelişimsel zamanda metin protokolünde tartışıldığı gibi transkript seviyelerini ve diğer fenotipik değişiklikleri inceleyin.

Burada gösterilen noktalar, beklendiği gibi normal görünen dördüncü instar anis gambi larvaları ile beslenen bir kontroldür. Bununla birlikte, para atrofik matris larvalarda bozulur, kitin enterferans yapan RNA ile beslenir, dekstrin mavisi tarafından kanıt olarak kitin sentaz birini hedef alır, bu da orkonun gastrik C anahtarı normal ekspresyonuna sızmıştır. Zorunlu koku verici koreseptör, dördüncü instar seksenler aegypti larvaları ile beslenen kontrol antenlerinde gözlenir.

Buna karşılık, kontrol ile beslenen hayvanlara kıyasla tek fikirli geni hedef alan tussin enterferansenti, RNA ile beslenen hayvanlarda Orco ekspresyonu yoktur. Tek fikirli bayıltma hayvanları, kusurlu koku izleme davranışına sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, vektör sivrisinek gelişimi sırasında genleri susturmak için Keon enterferansiyeli, RNA nanopartiküllerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalıdır.

Potansiyel olarak yetişkin sivrisineklerin veya diğer ortaya çıkan model organizmaların çalışmasına genişletilebilecek olan bu teknik, araştırmacıların hastalık vektörü, sivrisinek genom projelerinde tanımlanan genlerin işlevlerini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.