إنشاء طعم أجنبي نموذج المايلوما المتعددة الإنسان في الدجاج لدراسة نمو الورم والغزو والأوعية الدموية

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء نموذج لجنين الدجاج في الجسم الحي مع الورم النقوي البشري المطعمة والخلايا الوسيطة لدراسة آثار أدوية السرطان على نمو الورم والغزو وتكوين الأوعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد خلايا الورم النقوي البشري المتعدد المعدلة وراثيا لتحليلها في نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر وفي الجسم الحي. يتم نقل الخلايا باستخدام فيروس العدسات الذي يوفر GFP للتصور ومقاومة البلاستين لاختيار الخلايا المنقولة.

كخطوة ثانية 3D viroids. مع الخلايا المنقولة ، يتم إنشاء الخلايا الوسيطة والمصفوفة خارج الخلية ، مما يسمح بفحص الأدوية المضادة للسرطان على نطاق واسع في بيئة معقدة ثلاثية الأبعاد في المختبر. الورم 3D التالي.

يمكن زراعة PHE في الجسم الحي في أجنة الدجاج من أجل اختبار تأثيرات الأدوية الجديدة على نمو الورم والغزو وتكوين الأوعية. في النهاية ، يمكن توثيق حجم الورم واستجابات الأوعية الدموية يوميا وبعد القتل الرحيم. يمكن فحص الأورام بواسطة GFP و Eliza والكيمياء المناعية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل عكس نماذج الطعم الطبيعي هي ECX على التعامل مع الأورام البشرية وتصويرها. يمكن أن تنمو الخلايا السرطانية البشرية ذات الخلايا البشرية الداعمة ومركبات المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي وأجنة الدجاج التي لا تزال تفتقر إلى الاستجابات المناعية التكيفية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تطوير علاجات جديدة وتمكن من إجراء فحص سريع قبل السريري لعلاج المرضى الذين يعانون من الورم النقوي المتعدد.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خلايا الورم النقوي المتعدد البشرية تخضع بسهولة لموت الخلايا المبرمج بسبب الإجهاد ويمكن أن تموت أجنة الخد عند إساءة التعامل معها بسبب ظروف ثقافة exor المناسبة ، مما يدل على الإجراء وجميع خطواته الحاسمة سيكون كورنيليا. هيس وفني خبرة من مختبرنا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإعداد ثقافات خطوط خلايا الورم النقوي المتعددة ، و OPM اثنين من RPMI 8 2 2 6 ، والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية من نخاع العظام تحتضن الخلايا بشكل طبيعي في وسط مكمل باتباع بروتوكول النص لنقل مليون خلية ورم نخاعي متعدد مع 100 ، 000 جسيم فيروسي.

في صفيحة 24 بئرا مع وسط نمو كامل بعد ثلاثة أيام ، ابدأ في اختيار الخلايا المنقولة عن طريق إضافة ميكروغرامين من البلاستين لكل مليلتر من وسط الثقافة أو استخدم 500 ميكرولتر من النيومايسين لكل مليلتر لفيروس العدسات EGFP المتاح تجاريا بعد أسبوعين من الاختيار ، ابحث عن مجموعات من الخلايا التي تعبر عن EGFP. اجمع مجموعات الخلايا العائمة أو الملتصقة عن طريق تعليقها بعناية في حبيبات أنبوب الطرد المركزي ، وخلايا D-E-G-F-P عند 1000 GS لمدة خمس دقائق وتوسيعها كخطوط فرعية. بعد اختيار وانتشار GFP الذي يعبر عن خلايا الورم النقوي المتعددة ، تحقق دائما من قدرتها قبل استخدامها لمزيد من التجارب.

للبدء ، قم بتبريد بعض محلول الكولاجين من النوع الأول و 10 XDMM على الثلج. بمجرد أن يبرد ، امزج حجما واحدا أو عشرة من وسط 10 X-D-M-E-M في محلول الكولاجين. ثم أضف 0.2 هيدروكسيد الصوديوم العادي بالتنقيط لتحييد المحلول إلى درجة حموضة 7.4.

احتفظ بالمحلول على الجليد وتأكد من الرقم الهيدروجيني بشريط اختبار. بعد ذلك ، امزج خطوط خلايا الورم النقوي المتعدد المعدلة وراثيا مع الخلايا الوسيطة البشرية. الآن الطرد المركزي لخليط الخلية في أنابيب 15 ملليلتر عند 1000 Gs.لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وباستخدام ماصة P 1000 أعد تعليق الحبيبات في مليلتر من خليط الكولاجين البارد.

باستخدام طرف P 100 ، انقل على الفور 30 ميكرولتر من الخليط إلى البارافين المعقم. في صفيحة ثقافة 24 بئر ، اترك الخليط يتبلمر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وبالتالي تشكيل المنشطات. بعد ذلك ، قم بتراكب المنشطات بمليلتر من الوسائط المعدة بعلاجات مختلفة.

على سبيل المثال ، يمكن استخدام الدواء بتركيزات مختلفة. بعد 72 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بتوثيق PHE بواسطة الفحص المجهري الاستريو الفلوري. ثم باستخدام ملقط فكي مسطح عريض ، انقل كل ستيرويد إلى أنبوب تفاعل لقياس تعبير GFP.

استعدادا لهذا الإجراء ، احتضن بيض الدجاج في حاضنة بيض عند 37 درجة مئوية و 70٪ رطوبة لمدة ثلاثة أيام. ثم افتح البيض وانقل الأجنة إلى بلاستيك مربع معقم بحجم 10 سم ، ووزن القوارب مع الصفائح الدموية لزراعة الخلايا لتحقيق معدلات بقاء أعلى لأجنة الدجاج في ثقافة X OVO. استخدم قوارب الانتظار البلاستيكية بدلا من أنسجة الثقافة التي يبلغ طولها 10 سم.

علاوة على ذلك ، قم بتعقيمها وتثبيتها باستخدام قوارب انتظار PBS الطويلة قبل الاستخدام. استمر في احتضان البيض X ovo لمدة ستة أيام أخرى يتطور خلالها الطب التكمي التكميلي. الآن قم بإعداد الورم النقوي المتعدد والخلايا الوسيطة PHE كما في الإجراء السابق ، ولكن في صفيحة من ستة آبار ، ثم باستخدام ملقط ، قم بنقل الستيرويد كما هو الحال في النباتات إلى سطح الكاميرا غير المعالج على بعد حوالي سنتيمترين من جنين أجنة الدجاج البالغة من العمر تسعة أيام.

ضع أربعة على النباتات على كل جنين دجاج. دع الأجنة السابقة مع النباتات الموجودة في حاضنة البيض لمدة خمسة أيام. ثم قم بتوثيق الطعوم الغريبة عن طريق المجهر المجهري الفلوري.

بعد التوثيق ، استخدم مقص العيون والملقط لإزالة الطعوم الغريبة مع بعض أنسجة المخيم المجاورة. لقياس تعبير GFP أو لإجراء تحليل كيميائي مناعي ، ابدأ بنقل كل ستيرويد ورم نخاعي متعدد أو طعم غريب إلى 0.5 مل من RIPA مع مثبطات البروتين. ثم استخدم الخالط على الجليد لخلط الأنسجة بمجرد تجانسها ، وتجميد وذوبان المتجانسات باستخدام النيتروجين السائل ثم حمام مائي 37 درجة مئوية.

افعل ذلك ثلاث مرات ، ثم قم بالطرد المركزي للمجانسات عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة عند 12،000 جم وقم بتخزين المواد الطافية. بعد ذلك ، قم بتخفيف بعض المواد الطاففية من واحد إلى 20 في المخزن المؤقت للفحص لمجموعة ELIZA. ثم قم بقياس مستويات GFP باستخدام الأجسام المضادة للبيوتينيل المضادة ل GFP باستخدام مجموعة.

ابدأ بتثبيت الطعوم الغريبة بين عشية وضحاها في الفقرة فورمالديهايد. في اليوم التالي ، قم بتجفيف وتضمين الطعوم الغريبة الثابتة. أولا ، قم بتحميلها في أشرطة.

ثم حرك الكاسيت من خلال سلسلة كحول متدرجة. دع كل حمام يستمر لمدة ساعة كاملة وقم بإنهاء العملية بتضمين البارافين. بعد ذلك ، قم بعمل طعوم صغيرة بخمسة ميكرون باستخدام ميكروتوم دوار على الطاولة ، وقم بخبز أقسام البارافين المجمعة على شرائح زجاجية طوال الليل عند 56 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بتقسيم الأقسام باستخدام سلسلة كحول متدرجة متناقصة لمضاعفة الماء المقطر. يجب أن تكون الشريحة في كل حمام لمدة 10 دقائق فقط. الآن اتبع بروتوكول النص للاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المعنية وإجراء الكشف عن مقياس السعرات الحرارية باستخدام الإنزيم والركيزة بعد تلطيخ الجسم المضاد مع الهيماتين وتشريح التركيب بوسط تركيب اصطناعي.

اثنان من EGFP يعبران عن الورم النقوي المتعدد. تم إنشاء خطوط الخلايا في الزراعة لمدة ثلاثة أيام في وجود الدواء. ثم تم تصور الخلايا الورمية والستيرويدات في بورتيزوميب عن طريق التعبير عن GFP على مجهر فلوري مجسم

تم قياس كتلة الخلايا السرطانية بعد العلاج بالعقاقير بعد تجانس PHE وقياس محتويات EGFP بواسطة GFP Eliza. في تجربة أخرى ، تمت زراعة أجنة دجاج عمرها ثلاثة أيام X ovo لمدة ستة أيام. في اليوم التاسع ، تم تطعيم PHE لخلايا الورم النقوي المتعدد.

تم إرفاق أربعة على الطعوم النباتية بكل جنين. تم تطبيق المادة المستهدفة bortezomib موضعيا في مول واحد بعد خمسة أيام ، وشكلت النباتات أورام مقارنة بالضوابط. منع Bortezomib نمو خلايا الورم النقوي المتعددة في الكسب غير المشروع بناء على تصور كتلة الورم الفلوري.

ثم تم استئصال الكسب غير المشروع الفردي من ثلاثة مختلفة وتجانسها وبعد ذلك بواسطة GFP Eliza. بالمقارنة مع الضوابط ، كان لدى الأنسجة المعالجة بالبورتيزوميب كتلة خلايا الورم النقوي أقل بكثير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التجارب إذا كانت الخلايا السرطانية التي تهمك على الأجنة المزروعة لتحليل نمو الورم ونشأته وغزوه في الأنسجة المضيفة بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الورم النقوي المتعدد لاستكشاف المركبات أو الأدوية النبيلة في كائن حي نموذجي سهل التعامل معه ، وهو أمر ضروري لاختبار الأدوية قبل السريرية.