Name: Transformation biolistique dun fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique Cryptococcus neoformans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez la transformation biolistique pour l'intégration d'ADN marqué par fluorescence dans Cryptococcus neoformans. Cette méthode utilise un canon à gènes et des microporteurs d'or pour une intégration stable.

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Ce travail a été soutenu par des prix de la National Science Foundation (Award # 0920274) et l&#39;expérience de Caroline du Sud Projet de station de SC-1700340. Ce document isTechnical Contribution n ° 6283 de la station expérimentale de l&#39;Université Clemson. Les auteurs remercient le Dr Lukasz Kozubowski pour ses conseils utiles dans le développement de ce protocole final et le Dr Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, et Grace Kisirkoi pour leur lecture critique du manuscrit.

NOTE: Le régime global de ce protocole est décrit dans la figure 1. 1. C. neoformans Préparation <ol><li> Pour chaque réaction de transformation, 3.2 ml cultiver un O / N culture de C. neoformans en milieu YPD à 30 ° C sous agitation à 250 rpm. </li><li> Centrifuger la culture O / N pendant 5 min à 900 g à 10 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 300 pi de levure peptone dextrose (YPD) moyenne. </li><li> Utilisation des billes de verre, doucement propager 300 ul de la suspension cellulaire lavée sur de la gélose YPD contenant 1 M de sorbitol. </li><li> Permettre plaques sécher à température ambiante pendant 3-4 heures. </li></ol> 2. Préparation microsupports d&#39;or <ol><li> Remettre en suspension 0,25 g de 0,6 um perles d&#39;or dans 1 ml de ddH 2 O, centrifugeuse pendant 1 min à 900 xg pour sédimenter les perles, et retirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les billes d&#39;or dans 1 ml d&#39;éthanol à 100%. &lt;/ Li&gt; <li> Distribuer les billes dans quatre tubes, 250 ul chacun, et ajouter 750 ul d&#39;éthanol 100%. </li><li> Magasin perle en or aliquotes à 4 ° C. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;ADN <ol><li> Préparer disques macrosupport de biolistiques oranges en les immergeant dans 100% d&#39;éthanol en utilisant une pince. La place des disques dans une grande boîte de Pétri contenant driérite sécher (se assurer que le driérite ne touche pas les disques). </li><li> Une fois sec, appuyez sur les disques de macrosupport dans les supports de disques d&#39;argent (auparavant essuyé avec 100% d&#39;éthanol). </li><li> Vortex perles d&#39;or (préparé comme à l&#39;étape 2) et 12 ul aliquotes dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse, un tube par la transformation. </li><li> Ajouter à chaque tube dans l&#39;ordre: 2 ug d&#39;ADN (de préférence 2 ul de 1 ug / ul d&#39;ADN), 10 ul de 2,5 M de CaCl2, et de la base libre 2 ul 1 M de spermidine. </li><li> Mettre en place un contrôle négatif comme dans l&#39;étape 3.4 mais sans ADN. </li><li> Vortexer chaque tube et incuber à température ambiante pendant5 min. Tapotez doucement chaque tube à l&#39;occasion pour remettre en suspension les perles réglées au cours de cette incubation. </li><li> tubes à centrifuger à 225 g pendant 30 sec pour sédimenter les billes d&#39;or recouvertes d&#39;ADN. Retirer délicatement le surnageant (par la pipette ou aspiration) et le jeter. </li><li> Remettre les billes complètement dans 600 pi d&#39;éthanol à 100% par pipetage lentement de haut en bas. </li><li> Spin tubes à 225 g pendant 30 secondes pour sédimenter les billes sans emballage. Retirez délicatement et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les billes d&#39;or recouvertes d&#39;ADN dans 8 ul d&#39;éthanol à 100% en pipettant doucement de haut en bas. </li><li> Pipeter les billes enrobées d&#39;ADN or sur le centre du disque biolistique à un diamètre de 1 cm et laisser sécher. REMARQUE: Un cercle d&#39;or séché visible sur le centre du disque biolistique indique qu&#39;une concentration suffisante de perles d&#39;or est présent. REMARQUE: Les disques de macrosupport chargés de perles enrobées d&#39;ADN or sont maintenant prêt à utiliser avec le canon à gènes. </li></ol> 4. Oode Gene Gun <ol><li> Mettre la pompe à vide. </li><li> Ouvrez le gaz d&#39;hélium en tournant dans le sens inverse jusqu&#39;à une pression de 2200 psi environ est atteint sur la jauge de pression. </li><li> Allumez le canon à gènes en basculant l&#39;interrupteur rouge sur la gauche. </li><li> Assurez-vous que les débits pour le vide et l&#39;évent sont ajustés de sorte que le vide atteindra 28 pouces de Hg dans les 15 secondes. </li><li> Se assurer que la distance entre le disque de rupture et macrosupport est d&#39;environ 3/8 de pouce. </li><li> Nettoyez toute la chambre en l&#39;essuyant avec de l&#39;éthanol. </li><li> Immerger les disques de rupture à 100% d&#39;éthanol. Laisser sécher sur une surface stérile (par exemple, boîte de Pétri). </li><li> Utilisez une clé dynamométrique pour desserrer le support de disque de rupture. Insérez un disque de rupture propre dans le support. Vissez le support de disque de rupture en place et serrer avec une clé dynamométrique en tournant une fois vers la droite. REMARQUE: Les disques de rupture seront remplacés après chaque tournage. </li><li> Immerger etamis à mailles de e dans l&#39;éthanol 100%. Laisser sécher sur une surface stérile (par exemple, boîte de Pétri). </li><li> Une fois sec, placez un tamis à mailles lavé sur la plaque de montage en plastique blanc. Placez le côté d&#39;ADN de support de disque de macrosupport vers le bas dans la chambre de disque. Visser le capuchon argenté, et placez la plaque de montage au plus haut fente. REMARQUE: L&#39;écran de maille sera remplacé après chaque tournage. </li><li> Placer une plaque de gélose YPD contenant 1 M de sorbitol sur la plaque de fond. </li><li> Fermez la porte de la chambre et le verrouiller en place. </li><li> Appuyez et maintenez enfoncé le bouton rouge du milieu pour engager vide et permettre le vide pour atteindre 28 pouces de Hg. Une fois le niveau de vide adéquate est atteinte, déplacer le commutateur sur la position basse. Lorsque vous êtes prêt, maintenez l&#39;interrupteur rouge à droite au feu. Lorsque le disque de rupture apparaît, relâchez immédiatement le bouton de tir et appuyez sur l&#39;interrupteur rouge du milieu en position centrale pour évacuer la chambre à 0 psi. </li><li> Nettoyez les débris de disque de rupture et éteindre le canon à gènes. Puis éteignez le helium de gaz en tournant le bouton dans le sens horaire, et enfin, éteignez la pompe à vide. </li></ol> 5. Les cellules transformées Placage <ol><li> Laisser les plaques de transformation de se asseoir à la température ambiante pendant 4 heures pour permettre aux cellules de se rétablir. </li><li> Pipette 700 pi de YPD sur la plaque. Utilisez un grattoir cellulaire pour gratter délicatement les cellules hors du liquide agar et pipette dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile. Répétez cette étape pour se assurer que toutes les cellules ont été récupérés sur la plaque. </li><li> Pellet cellules à 225 g pendant 30 sec. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans 500 pi de YPD. </li><li> Pipette 100 ul de la suspension cellulaire sur le centre des plaques + antibiotiques YPD et la propagation utilisant des billes de verre. </li><li> Laissez plaques inversées à température ambiante pendant 3-4 jours. Comme les colonies apparaissent, transdermique sur la nouvelle YPD + plaques antibiotiques. </li></ol> 6. Isolement d&#39;ADN génomique pour la PCR NOTE: Ce est une version modifiée en utilisant le réactifs à partir d&#39;un kit de purification d&#39;ADN (voir le tableau des matériaux). <ol><li> Cultiver une culture de 5 ml de chacun des C. neoformans transformants dans YPD liquide à 30 ° C sous agitation à 250 rpm O / N. </li><li> Pellet 3 ml de cellules à 900 xg, et remettre en suspension dans 600 ul de solution de lyse des noyaux. </li><li> Ajouter la suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec 200 ul d&#39;acide 0,5 mm de billes de verre lavées. </li><li> Homogénéiser pendant 45 secondes dans une mini BeadBeater à température ambiante, le tube refroidir sur glace, et répéter. </li><li> Laisser l&#39;échantillon se installer sur la glace pendant 2 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ajouter 200 ul de solution de précipitation des protéines à chaque tube, (100 ul pour chaque tranche de 600 ul de surnageant récupéré) et vortexer vigoureusement pendant 20 s. </li><li> Laisser les échantillons se déposent sur la glace pendant 5 min, et centrifuger à 11 000 g pendant 3 min. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube de 1,5 ml propre contenant 300 pi de RT isopropanol. Mélanger doucement par inversion. </li><li>Centrifuger les échantillons à 11 000 g pendant 2 min, retirez délicatement le surnageant, et égoutter les tubes sur du papier absorbant. </li><li> Ajouter 300 pi de RT 70% d&#39;éthanol à chaque tube et inverser doucement pour laver le culot. </li><li> Centrifuger les échantillons à 11 000 g pendant 2 min et retirez soigneusement totalité de l&#39;éthanol. </li><li> Égoutter le tube sur des serviettes en papier propre, et de permettre le culot sécher à l&#39;air pendant 10-15 min. </li><li> Ajouter 50 pi de solution de réhydratation ADN et 1,5 pi de solution RNase à chaque pastille et le vortex. </li><li> Centrifuger les échantillons pour 5 sec pour enlever tout le liquide par le bouchon. </li><li> Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Réhydrater l&#39;ADN par incubation des échantillons à 65 ° C pendant 1 heure. </li><li> Quantifier l&#39;ADN par spectrophotométrie en mesurant l&#39;absorbance à 260 nm (un A 260 lecture de 1,0 équivaut à ~ 50 pg / ml d&#39;ADN double brin), et d&#39;utiliser jusqu&#39;à 200 ng dans chaque réaction PCR. </li></ol> 7. Isolement de l&#39;ARN pourTranscriptase inverse-PCR. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un kit de purification d&#39;ARN (Voir le tableau des matériaux), suivre les instructions du fabricant pour isoler l&#39;ARN à partir de cellules de levure en utilisant un minibeadbeater. </li><li> Quantifier la concentration de l&#39;ARN en mesurant l&#39;absorbance à 260 nm (260 A une lecture de 1,0 est équivalente à ~ 40 pg / ml d&#39;ARN simple brin). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un kit RT-PCR (Voir le tableau des matériaux), suivre les instructions du fabricant de mettre en place des réactions de RT-PCR avec environ 1 ug d&#39;ARN. Pour les résultats obtenus dans cette étude, utiliser les amorces énumérées dans le tableau 1. </li></ol>

<ol><li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li>
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<li>Del Poeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+is+essential+in+Cryptococcusneoformans%3A+role+In+pathobiology+and+as+an+antifungal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target.</a> Genetics. 152, 167-178 (1999).</li>
<li>McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+transformation+of+Cryptococcusneoformans+and+Cryptococcusgattii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3AFG+%26+B%22%5BJournal%5D)">High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

En utilisant ce protocole, une transformation biolistique peut être accomplie dans laquelle l’ADN linéaire est intégré dans un locus souhaité dans le génome de Cryptococcus neoformans par recombinaison homologue. Certaines étapes du protocole peuvent avoir un effet dramatique sur l’efficacité ou l’efficience de la transformation. Pour une transformation réussie, il est impératif que l’ADN utilisé dans la pousse ait une concentration d’au moins 1 μg. Cependant, le volume d’ADN ajouté aux billes d’or peut être aug...

Cryptococcus neoformans, un pathogène opportuniste envahissant du système nerveux central, est la cause la plus fréquente de méningite fongique, entraînant plus de 625 000 décès par an dans le monde 1. Il a été démontré que l’acétate est un produit de fermentation majeur lors de l’infection cryptococcique 2,3,4, et il a été démontré que les gènes codant pour les enzymes de trois voies présumées de production d’acétate sont régulés à la hausse pendant l’infection 5. Cela suggère que la production et le transport de l’acétate peuvent être une partie nécessaire et requise du processus pathogène ; Cependant, l’importance de cela n’est pas encore comprise. Une voie possible pour la production d’acétate est la xylulose 5-phosphate/fructose 6-phosphate phosphocétolase (Xfp) - acétate kinase (Ack), une voie que l’on pensait auparavant présente uniquement chez les bactéries mais récemment identifiée chez les champignons euascomycètes et basidiomycètes, y compris C. neoformans 6.
Pour déterminer la localisation de ces enzymes de cette voie dans la cellule, une construction portant un gène de résistance à la néomycine en aval de la fusion d’un gène ACK vers l’étiquette fluorescente mCherry (ACK :mCherry :Neo) sera introduite dans C. neoformans en utilisant la méthode bien établie de transformation biolistique 7,8. Bien que l’électroporation soit une méthode efficace pour la transformation des plasmides qui seront maintenus sous forme d’épisomes en Cryptococcus 9, elle n’est pas utile pour créer des transformants homologues stables 8. Seule l’administration biolistique à l’aide d’un pistolet à gènes fournit un moyen efficace de transformer des ADN linéaires qui seront intégrés dans le génome par recombinaison homologue. Par exemple, Edman et al. ont montré que parmi les transformants résultant de l’électroporation d’un marqueur sélectif URA5 porté par un plasmide dans les mutants ura5 de C. neoformans, seulement 0,001 à 0,1 % des transformants étaient stables 9. Chang et al. ont atteint une efficacité de transformation stable de seulement 0,25 % en utilisant l’électroporation pour reconstituer la production de capsules dans un mutant acapsulaire 10. Contrairement à l’électroporation, il a été démontré que la transformation biolistique entraîne une efficacité de transformation stable de 2 à 50 % selon le gène qui est altéré 7,8,11. 
Cette expérience visuelle fournira une démonstration étape par étape de la transformation biolistique de la construction linéaire de l’ADN ACK :mCherry :Neo en C. neoformans, et décrira comment confirmer sa bonne intégration par recombinaison homologue dans le locus ack. Le protocole présenté ici est une modification de la méthode développée dans le laboratoire Perfect 8.

<table><tbody><tr><td>0,6 &mu ; m billes d’or</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Base sans spermadine</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418 - Sulfate (Néomycine)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-418-10</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350 psi Disques de rupture</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Écrans d’arrêt</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>http://www.bio-rad.com Disques macroporteurs</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD</td><td>Broth Becton Dickinson & Co.</td><td>242820</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td>http://www.fishersci.com</td></tr><tr><td>PDS-1000/He Système</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td>Microscope http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD One Step PCR Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>One Étape RT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard Kit de purification d’ADN génomique</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Mini Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td>http://www.biospec.com</td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Centrifugeuse Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td>www.beckmancoulter.com</td></tr><tr><td>spectrophotomètre à microplaques</td><td>BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

transformation biolistique d&#39;un fluorescent tagged gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Le basidiomycète de Cryptococcus neoformans, un pathogène opportuniste invasive du système nerveux central, est la cause la plus fréquente de méningite fongique dans le monde entier résultant dans plus de 625 000 décès par an dans le monde. Bien que l&#39;électroporation a été développé pour la transformation de plasmides dans Cryptococcus, ne délivrance biolistique fournit un moyen efficace pour transformer ADN linéaire qui peut être intégré dans le génome par recombinaison homologue. Acétate a été montré pour être un produit de fermentation majeure lors de l&#39;infection à Cryptococcus, mais l&#39;importance de ce ne est pas encore connu. Une voie bactérienne composé des enzymes xylulose-5-phosphate / fructose-6-phosphate phosphocétolase (Xfp) et l&#39;acétate kinase (ACK) est l&#39;une des trois voies possibles pour la production d&#39;acétate de C. neoformans. Ici, nous démontrons la transformation biolistique d&#39;une construction,qui a le gène codant Ack fusionné au marqueur fluorescent mCherry, en C. neoformans. Nous confirmons donc l&#39;intégration de la fusion ACK -mCherry dans le locus ACK.

Une transformation biolistique réussie de C. neoformans peuvent être obtenus en suivant le schéma de protocole (figure 1). Avec la transformation biolistique, un lancement réussi des billes d&#39;or recouvertes est indiqué par un anneau d&#39;or visible sur la plaque après que l&#39;ADN est prise (figure 2A). Colonies devraient apparaître dans les 4 à 5 jours lorsqu&#39;il est laissé à la température ambiante après étalement des cellules récupérées à partir des plaques de sorbi...

Transformation biolistique est une méthode utilisée pour générer une intégration stable de l&#39;ADN dans le génome de l&#39;agent pathogène Cryptococcus neoformans opportunistes par recombinaison homologue. Nous démontrerons transformation biolistique d&#39;une construction, qui a la kinase acétate de codage de gène fusionné au marqueur fluorescent mCherry en C. neoformans.

Transformation biolistique d&#39;un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir une démonstration étape par étape de la transformation biotique d’une construction linéaire contenant une étiquette fluorescente. Pour ce faire, il suffit d’abord d’enduire des perles de microvoiture en or avec l’ADN qui les intéresse. Dans la deuxième étape, l’ADN est transféré aux cellules C neo forin par le pistolet à gènes.Les cellules transformées sont ensuite plaquées, et l’intégration de la construction de l’ADN est évaluée par PCR et R-T-P-C-R. Enfin, la microscopie fluorescente est utilisée pour confirmer la bonne intégration du produit de l’ADN par recombinaison homologue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’électroporation, est que la transformation BIC entraîne une intégration stable dans le génome du bureau cryptographique.Proche de la performance. La démonstration de cette technique est assurée par Tanya Taylor, une étudiante au doctorat de mon laboratoire, qui est devenue compétente dans cette technique. Commencez par immerger à l’aide d’une pince des disques BIC macro-porteurs orange dans de l’éthanol à 100 %, puis transférez les disques dans une grande boîte d

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Nous présentons ici une description unifiée de techniques qui peuvent être utilisés pour développer, transformer, administrer et tester l'expression de protéine hétérologue de la levure probiotique Saccharomyces boulardii.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

La modification du gène à médiation par PCR peut être utilisée pour générer des fusions de protéines fluorescentes dans des espèces de Candida, ce qui facilite la visualisation et la quantification des cellules de levure et les protéines. Ici, nous présentons une stratégie pour la construction d' une protéine de fusion fluorescente (ENO1-FP) dans Candida parapsilosis.

Génération de fusions de protéines fluorescentes dans<em&gt; Candida</em&gt; espèces

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Ce manuscrit décrit une méthode de criblage de banques mutantes de Candida albicans de taille moyenne pour les phénotypes de morphogenèse au cours d’une infection active chez un hôte mammifère en utilisant la microscopie confocale non invasive.

Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

Ce protocole utilise un rapporteur bioluminescent, permettant de mesurer l’activité transcriptionnelle chez Saccharomyces eubayanus pour surveiller la transition glucose-maltose, permettant une analyse en temps réel des adaptations métaboliques et soutenant l’optimisation des souches pour la fermentation industrielle dans diverses conditions.

In vivo Suivi de l’activité transcriptionnelle pendant la transition métabolique à l’aide d’un rapporteur bioluminescent chez la levure

Découvrez la transformation biolistique pour l'intégration d'ADN marqué par fluorescence dans Cryptococcus neoformans. Cette méthode utilise un canon à gènes et des microporteurs d'or pour une intégration stable.

Transformation biolistique d'un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique

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