Name: 从中央与EAE大鼠中枢神经系统的单核细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:23:00.000+00:00
Duration: 20 min 51 s
Description: 学习从实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统中分离单核细胞的方法。该方案采用心脏灌注去除血液污染，结合Percoll密度梯度离心技术，可获得高活性单核细胞用于流式细胞术、电生理或细胞培养等下游应用。

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<ol>
<li> 深度麻醉大鼠。用70%乙醇喷洒，并通过左心室灌注PBS 10分钟以清除血管中的细胞（剪开右心房，从左心室进行灌注）。</li>
<li>取出脑和脊髓，置于含有冰上预冷PBS的50 ml离心管中。将脑和脊髓组织置于放置在含10 ml冰上预冷PBS的10 cm培养皿中的70 mm细胞筛网上，使用无菌1 ml注射器活塞背面将每块组织压过细胞筛网。将获得的单细胞悬液收集至冰上预冷的50 ml离心管中。用PBS冲洗细胞筛网，并将冲洗液加入离心管中，直至溶液澄清。</li>
<li>以390 g离心8–10分钟。</li>
<li>将细胞重悬于20 ml PBS + 30% Percoll溶液中，然后铺在10 ml PBS + 70% Percoll溶液之上。</li>
<li>室温下以390 g离心20分钟。</li>
<li>去除管顶的脂肪层。收集界面处的细胞，用PBS洗涤两次，计数。</li>
</ol>

<ol><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+clinical+scoring+of+chronic-relapsing+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.</li>
</ol>

该操作步骤以及所有涉及活体动物的操作步骤，均须获得您所在机构的动物使用与护理委员会的批准。我们建议在首次进行心脏灌注时，应有兽医或兽医技术人员在场，以确保动物在操作前和操作过程中接受足够水平的麻醉，并确保动物不会遭受不必要的疼痛或痛苦。

<table><tbody><tr><td>PBS，1×，无菌</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网，70 µm</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td></td></tr></tbody></table>

从患eae大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

无论是研究针对中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病（例如实验性自身免疫性脑脊髓炎，EAE，1），还是研究对中枢神经系统感染（例如脊髓灰质炎、莱姆神经伯氏疏螺旋体病或神经性梅毒）的免疫反应，通常都需要分离浸润到中枢神经系统的免疫细胞。
在本视频方案中，我们演示如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的大鼠中枢神经系统（CNS）中分离单个核细胞（MNCs）。该操作的第一步是用生理盐水对啮齿动物进行心脏灌注，以确保灌注中枢神经系统的血管中无残留血液。任何血液污染都会人为地增加表观CNS浸润MNCs的数量，并可能改变免疫细胞浸润群的表观组成。随后，我们演示如何取出大鼠的脑和脊髓，进行后续的机械性破碎，以制备单细胞悬液。该悬液通过两层Percoll密度梯度离心法分离以获取MNCs。经洗涤后，这些细胞即可用于后续所需的任何实验操作。
通过该方法分离的单个核细胞具有活性，可用于电生理学、流式细胞术（FACS）或生物化学实验。若在无菌条件下操作（使用无菌器械并在组织培养罩内进行），这些细胞也可在组织培养基中进行培养。特定的细胞群体可进一步通过磁性分离方法或流式细胞术进行纯化。

在本视频中，我们演示了如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞。

从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

无论是研究针对中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病，例如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，1），还是……

好的。大家好，我是Christine Beaton，加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。今天我将向大家演示如何从大鼠的中枢神经系统中分离单个核细胞。因此，该操作需要对大鼠进行深度麻醉，以实施心脏灌注，从而确保中枢神经系统内无血液污染。取出组织后，我们将分离脑和脊髓，使用细胞筛制备单细胞悬液，然后利用Percoll双层梯度离心法分离单个核细胞。现在我们开始操作。现在我已准备好进行心脏灌注，接下来我将展示所需的所有材料。首先，我们需要一个贝尔罐，罐子底部放置了浸有挥发性麻醉剂的纸巾。你可以使用异氟烷或异氟醚。接下来我们需要准备固定大鼠的装置以及收集血液的工具。因此我们搭建了这个临时装置用于大鼠灌流。你将使用21号针头，并通过静脉输液灌流系统利用重力作用灌注生理盐水溶液。如果无法使用上述系统，也可以用生理盐水填充多个注射器，然后手动进行灌注。但这种方法要简便得多。此外，我们还需要一个10毫升的注射器筒，其中已放入了Kim擦拭纸。我将把麻醉剂，即部分麻醉剂，涂抹在大鼠的鼻部，以确保其在操作过程中保持深度麻醉状态。当然，你还需要准备相应的器械。今天我将不进行无菌操作，因为我不会将细胞放入培养环境。因此，我所使用的所有器械在无菌方面均未作处理。但如果您打算将细胞进行培养，显然应当使用无菌器械。就本视频的目的而言，我将使用一只已死亡的大鼠。因此，我可以放慢操作速度，逐步向您展示。当然，在实际操作中，您需要一只深度麻醉但未死亡的大鼠，且心脏仍保持跳动。现在我们开始处理这只大鼠。我将大鼠放置好，使其背部朝向远离我的方向，并用浸湿的擦拭巾覆盖其鼻部。接下来，我要做的第一件事是检查大鼠是否已处于深度麻醉状态。因此，在进行每个上述操作之前，你都需要这样做。我用镊子夹住大鼠，大鼠完全没有反应。如果大鼠有任何反应，就需要将其放回麻醉装置中，以确保其处于深度麻醉状态。然后我将使用70%乙醇浸泡大鼠的上半部分。接着我将打开胸腔。首先，我会切开皮肤，并从侧面打开。然后我将打开体腔本身。这里的这个组织是心脏。这里可以看到右心房。这就是我要剪开以使血液流出的地方。然后，为了灌注整个身体，我需要将针头插入左心室。因此，我将针头从这里插入。当针头插入后，我将打开输液管，使生理盐水流入，持续五到十分钟。如果灌注效果良好，你会观察到大鼠的脉搏、鼻子和眼睛的红色逐渐褪去，这表明血液正从大鼠体内排出，说明灌注效果良好。这是心脏灌注后的红色示踪结果。如您所见，这只小鼠的鼻子、耳朵和眼睛已不再呈粉红色或红色，而是完全变白，这表明灌注效果良好。血液已全部或大部分从大鼠的体表斑点处流失。现在大鼠已完成心脏灌注，我需要将其头部切断，即进行断头操作。为此，我将使用常规的实验设备。现在，我将从大鼠体内取出脑组织。因此，先用70%乙醇浸湿所有毛发，以避免毛发四处飞散。然后，我将

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生物学

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从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

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