組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います

この手順の全体的な目標は、凍結アーティファクトの作成など、筋生検から凍結切片を準備する際の落とし穴を回避することです。これは、最初に液体窒素で冷却された2つのメチルブタンで筋肉を急速に凍結することによって達成されます。筋生検がクライオスタットで平衡化した後、最適な切断温度、中程度、室温で少量ずつ、エアロゾル冷却と熱抽出を使用して急速凍結して埋め込まれます。

次に、7ミクロンの切片をスライスし、温かく正に帯電したスライドガラスに移します。最後のステップは、組織の組織型を評価するために、必要に応じて組織切片を染色することです。最終的に、正しく準備された筋生検により、アーティファクトが凍結することなく、組織の組織型が良好に維持されます。

したがって、パラフィン包埋組織切片などの他の既存の方法に対するこの技術の主な利点は、非常に迅速で、内因性抗原の構造や機能を変更しないことです。この方法は、成長、再生、炎症、線維症、壊死など、筋肉生物学の健康と疾患における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、健康な筋肉と病気の筋肉の状態を判断できるため、筋肉障害の治療または診断にまで及びます。

この方法は、さまざまな形態の筋ジストロフィーに関する洞察を提供できますが、がんの末期に関連する悪液質や、高齢者のエイズや筋肉の喪失などの他のシステムにも適用できます。まず、ヒュームフードの下やベルジャーなどの二次的な封じ込めで、フッ素のイソフを過剰に摂取したマウスを安楽死させます。動物のフットパッドをしっかりと握って、動物の死を確認します。

次に、70%アルコールで毛皮を濡らします。これにより、抜け毛が筋肉にくっつくのを防ぎます。5番の細い鉗子を使用して、手足の皮膚をはがすことから進めます。

腱から始めて、目的の筋肉を骨から慎重に分離します。この場合、脛骨前方は分離されます。筋肉を切除した後、OCTで覆い、ラベル付きの使い捨て凍結型に平らに置きます。

スライスする前に、後でOCTが追加されます。筋肉が頭から尾の軸に沿って正常な生理学的向きにあり、筋肉が伸びていないことを確認します。さあ、落ち着いてください。

液体窒素を使用したスチールビーカーの中のいくつかのイソップペンタン。プラスチック製のヘラで3〜5分かけて断続的にかき混ぜます。白い沈殿物が形成されると、この時点で最適な温度のイソップペンタンが形成され、装填した金型を溶液に浸します。

横隔膜や指伸筋などの小さな筋肉は、最長で6〜12秒かかります。大きな筋肉は15〜20秒以上必要で、凍結するとひび割れにつながる可能性があります。次のステップは、凍結した組織をドライアイスの上に置いて、残留イソップペンタンを蒸発させることですが、これには約15〜20分かかります。

ティッシュが乾いたら、ホイルで素早く箔を貼り、切片にできるまでマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。セクショニングの前に。ドライアイスで凍結した組織をクライオスタットに輸送します。

組織をマイナス24度からマイナス20度の間に設定されたクライオスタットチャンバーに移し、30分間平衡化させます。この温度では、組織は完全には解凍されません。次に、最初にティッシュを埋め込みます。

可能な場合は、ペルチェ湾の冷却をオンにします。次に、試料ディスクにOCTの均一な薄層を塗布し、冷まします。第三に、OCTが下部で凍結したが、上部がまだ液体になったら、組織を挿入し、組織を横断面の場合はOCTに対して垂直に、縦断面の場合はOCTに平行に向けます。

次に、エアロゾル冷却スプレーを使用してOCTをすばやく凍結します。次に、ティッシュの未発明部分に熱抽出器で触れ、ティッシュに45秒間保持します。このプロセス中は、どのステップでも筋肉を解凍させないでください。

クライオスタットにペルチェベイ冷却がない場合は、エアロゾル冷却を使用して、組織の周りのOCTをすばやく凍結します。次に、エアロゾル冷却スプレーを使用してマッスルスプレーの周りにOCTの薄い層を追加し、前の手順と同様に熱を抽出します。OCTを少しずつ追加し続け、エアロゾル冷却スプレーとヒートエクストラクターの組み合わせを使用して、筋肉全体が覆われるまでOCTをすばやく凍結します。

次に、ヒートエクストラクターをティッシュブロックの上に置き、5分間待ってから切片化に進みます。これで、試料を試料ヘッドに取り付ける準備が整いました。まず、つまみを締めてディスクを固定します。

チャンバーがマイナス24度からマイナス20度の間にある間、試料ディスクが試験片ヘッドにしっかりと接触していることを確認してください。チャンバーが温度にあるときにスライスの厚さを7ミクロンに設定し、ブロックのトリミングを開始します。コースと微調整を使用してブロックを動かします。

セクションを収集する準備ができたら、プラスに帯電したスライドを温めたランプに上面を押し付けます。正しく凍結すると、ティッシュの表面は白亜質になります。ただし、取り付けプロセス中に凍結、不適切、または解凍された組織は、赤からピンクに見えます。

スライドは、将来の分析のためにディープフリーザーに保存できます。組織の中腹部は、イメージングソフトウェアパッケージのトレース機能を使用して位相差画像から断面積を測定することにより特定できます。この解析では、面積と最小フェレット径の両方の測定値が得られます。

これらの測定値が横ばいになり始めると、腹部の中央に達しています。ほとんどの染色プロトコルでは、メーカーが段階的な指示を提供していますが、最適な染色強度を達成するためには、個人的な最適化が必要な場合があります。OCTを削除する必要はありません。

染色には、最適な免疫染色のために、必ず加湿チャンバーを使用してください。濡れたペーパータオルの上に置いたパーフィルで覆い、切片の乾燥を避けるために小さな箱に密封する必要があります。非免疫染色パーマネントマウントスライドの染色プロセスでは、染色プロトコルに従って、アルコールのグレードを増やしてスライドを脱水します。

封入剤は水で見逃せないため、100%キシレンで5分間の浴槽でスライドを清らかにします。これにより、スライドが時間の経過とともに不透明になることはありません。その後、埋入を進め、脛骨前方の腹部中央部の切片を染色した

ヘマチンとエオインを使用します。適切に処理された切片は、凍結損傷を受けたり、時期尚早に処理された不適切に処理された筋肉全体に一貫した形態を持ち、染色さえします。解凍されたものは、形態に複数の切れ目があり、細かく刻まれた小麦のように見えます。

免疫組織化学もこれらの切片で実施した。これらの汚れは満足のいくものでした。フィブロネクチンは緑色に染色され、ダッピーは青色に染色されています。

このビデオを見た後、筋肉の構造を評価するために、筋生検から良好な凍結切片を準備する方法を完全に理解しているはずです。一度習得すると、これらのステップがすべて適切に行われれば、このテクニックは約4〜5時間で完了します。この手順を試みるときは、この手順に続いて筋肉の融解を防ぐことを覚えておくことが重要です。

免疫染色やハイブリダイゼーションへの洞察などの他の方法を実行して、成長や再生などの追加の質問に答えることができます。