Name: 동시 생체 기능 테스트로 생체 전위도 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 학습하세요 생체 외 전기망막도(ERG)를 이용해 격리된 쥐 망막의 세포 기능을 평가하는 방법을. 약리학적 기법으로 막대세포와 원추세포 신호 전달 경로를 분석하여 망막 생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 보조금 EY019312과 EY021126 (VJK), 워싱턴 대학 안과학 교실 및 Visual 과학에 EY002687에 의해 지원되었다, 연구에 의해 실명을 방지 할 수 있습니다.

모든 실험 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라했고, 워싱턴 대학의 기관 동물 연구위원회에 의해 승인되었다. 1. 관류 및 시편 홀더 설정 <ol><li> 실험의 날에 신선한 망막 관류에 대한 솔루션을 준비합니다. 증류수 및 탈 이온수를 사용합니다. 다음 세 가지 방법 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 미디어와의 NaHCO3 1.9 G : &#39;에임스 1 병 (1ℓ) 솔루션&#39;을 에임스를 중탄산염이 함유 준비 </li><li> (MM)에 로크의 솔루션 준비 : 112.5 염화나트륨, 3.6의 KCl, 2.4의 MgCl 2, 1.2 CaCl2를, 10.0 HEPES를, 20.0 NaHCO3를, 3.0 나 숙시 네이트, 0.5 나 조미료, 0.02 EDTA, 10.0 포도당, 0.1 % MEM 비타민과 아미노산 산 </li><li> (MM)에 준비 HEPES 완충 벨소리 솔루션 : 133.3 염화나트륨, 3.3의 KCl, 2.0의 MgCl 2, 1.0 CaCl2를, 10.0 포도당, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH를1 M의 NaOH 5.8 ml의 ~ 7.5로 조정, 0.72 G / L Leibovitz 문화 매체 L-15을 추가합니다. 어떤 관류 매체를 사용하여 광 수용체 응답을 분리하는 100 μm의 BaCl 2 - 50 μm의 DL-AP4 50 - 20를 사용합니다. </li></ol></li><li> (MM)에 전극 (28)에 대한 솔루션을 준비 : 140.0 염화나트륨, 3.6의 KCl, CaCl2를, 3 HEPES, 0.01 EDTA 2.4의 MgCl 2, 1.2 및 7.4에 pH를 조정 - NaOH로 7.5. 전극 액은 수개월 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 준비하고 시편 홀더를 테스트합니다. <ol><li> 시험편 홀더의 바닥 부의 돔 위에 블랙 / 회색 여과지를 붙인다 (도 1A 참조). 돔 플랫 탑의 가장자리 주위 신중 이성 분 5 분 에폭시 접착제를 확산. 필요한 경우, 해부 현미경으로 그것을 할. </li><li> 접착제가 거의 건조 (약 4 분)이 될 때까지 기다렸다가 평면 항목을 사용하여 돔에 여과지를 누릅니다. 접착제 종이 필터 실험 전에 적어도 하루.여과지를 여러 번 사용할 수 있지만, 레코딩 개월 후에 교체되어야한다. 대체 용지를 설치하기 전에 접착제 잔류 물에서 조심스럽게 지붕을 청소하는 70 % 에탄올을 사용합니다. </li><li> 전극 액은 공기 방울을 방지하고 전극 채널로 나사산 어댑터로 둘러싸인 펠렛 전극 (도 1A 및 B 참조)하려고 나사가 구비 된 전극 채널을 채운다. 네 개의 나사와 시편 홀더의 상단과 하단 부분을 연결하고 전극 용액으로 관류 라인을 입력합니다. </li><li> 멀티 미터 (그림 1B)를 사용하여 각 전극 쌍의 리드 사이의 저항과 전압을 측정합니다. 저항 100 Ωk 10 MV 아래의 전압 채널 거품 무료이며 전극이 좋은 상태에있는 경우 이하이어야한다. </li></ol></li><li> 유리 병에 관류 매체의 700 mL의 - 400 붓는다. 또 다른 300 ㎖의 망막 및 S 해부에 사용되는 별도냉장고에서 그것을 찢었다. 열교환 블록 관류 튜브를 설정하고 가열판에 예열 된 블록을 배치 (도 1d 참조). </li><li> (그림 1D 참조) (에임스 &#39;또는 로크를 사용하는 경우) 연결이 2 / O 2 가스를 공동가 캡 병 및 관류 튜빙을 묶습니다. 37 O C의 미디어와 병을 예열 및 가열 플레이트 또는 37으로 설정 물을 욕조에 빛 자극 장치의 상단에 배치 - 39 O를 C (17). <ol><li> 국무 중력 중심의 흐름을 시작 관류 미디어를 작성하여 관류 라인. <ol><li> LKC 시스템에서, 다음 실험 기간 동안 병에 관류 용액의 저하 수준에 의해 영향을받지 않고, 유량 조절기에 의해 조절되는 중요한 중력 유동을 제공하도록 자극 부 (17)의 위쪽에 용기를 배치했다. </li><li> Ocuscience 시스템에서, P를 배치시편 홀더 긴 관류 출력 라인 노이즈를 최소화하고 배치하기 위해 패러데이 케이지 안에 erfusion 병 용액의 중력 구동을 증가시키는 잘 시험편 홀더 (관류 병)의 레벨 이하 (단계 2.8 참조). 이러한 출력 라인을 방패 ERG 신호에 전자 노이즈의 커플 링을 방지하도록 상기 증폭기의 접지에 실드를 연결한다. </li></ol></li></ol></li><li> 유량 조절기를 사용하여 / 분을 5 ml - 3 관류를 조정합니다. 적절한 규제와 실린더에서 5 % CO 2 / 95 % O 2 가스를 연결하고 공기 돌을 통해 병에 미디어의 꾸준한 버블을 보장하기 위해 유량을 조절합니다. </li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 직선 블레이 딩 microscissors, 하나 또는 두 개의 45 O 핀셋, 면도날 및 필터 종이의 사각형 조각을 포함하여 깨끗하고 날카로운 해부 악기를 조립합니다. </li><li> 감기 perfu의 약 200 ml에 붓고큰 페트리 접시에 시온 용액 (돔 포함) 시험편 홀더의 전체 바닥 부분 용액에 침지 될 수 있도록. 돔의 망막을 장착 할 때이 단계가 중요하게된다 (단계 2.6 참조). 일부 솔루션 carbogen (5 % CO 95분의 2 %의 O 2)로 포화되도록 설계되어 있지만, 이는 해부 상업적 필수적이지 여기 기재된 실험을 수행하지 않았다. </li><li> 녹음하기 전에 12 시간 - 전형적인 실험, 어두운 / 라이트 사이클과 6을 어두운 - 적응 12/12 시간에 동물을 유지. (현미경 광원 앞에 예를 들어, 빨간색 필터를 사용) 희미한 붉은 빛 아래 자궁 전위 다음 이산화탄소 흡입 동물을 안락사 및 어두운 빨간색 또는 적외선 조명 아래 모든 다음 절차를 수행합니다. <ol><li> 핀셋을 사용하여 눈을 잡아 당겨 미디어에 넣어. 페이퍼 (예를 들어, 일부 정규 여과지)의 작은 조각에 한번에 하나의 눈으로 만들어 놓고핀셋 눈 (이 여기에 솔루션의 외부에서 수행되는) 잡고 오라 세라의 수준에 약 조명. </li></ol></li><li> 오라 세라 따라 절단 (또는 가까운 눈의 적도에) microscissors와 각막과 렌즈를 제거합니다. 큰 페트리 접시에 차가운 미디어에서 아이 컵을 놓고 다른 눈으로 동일한 절차를 반복합니다. </li><li> 가능한 손상으로 망막을 유지하기 위해 망막과 공막 사이에 위를 유지하여 시신경 향해 아이 컵의 상단에서 작은 절개를 잘라. 그립 개의 핀셋을 사용하여 망막 분리를 위해 서로 떨어져 핀셋 당겨 의해 절개 양측으로부터 공막. <ol><li> 시신경을 잘라 말단 표면에 물리적 인 접촉의 최소 금액으로 망막을 분리하려고합니다. RPE 주로 박리 과정에서 자동 망막 분리한다. 그것은을 수행하는 것보다 망막의 기계적 교란을 피하기 위해 더 중요해부 빠르게 망막은 일반적으로 응답 특성에 심각한 영향없이 용액 중에서 적어도 30 분 동안 항온 처리 할 수​​있다. </li></ol></li><li> 시편 홀더 (그림 1C)의 돔에 망막를 탑재합니다. 해부 망막으로 페트리 접시에 시료 홀더의 바닥 부 담가. 돔 상기 망막 위쪽 감광체 측 (절연 망막의 볼록면)을 밀어 망막 여과지에 부착되도록 시험편 홀더를 해제. 다른 망막에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 전기 망막 사이의 크로스 토크뿐만 아니라 노이즈와 신호 입환을 방지하기 위해주의 깊게 홀더 플레이트를 건조. 시험편 홀더는 홀더의 하부 및 상부 부분 사이의 액 유출을 방지 할뿐만 아니라 개별 망막의 감광체 및 신경절 세포 양쪽의 전기적 분리를 돕기 위해 바닥 부 돔 주위에 O 링을 갖는다. (네 개의 나사와 홀더의 상단 부분을 연결도 1b 참조), 주사기와 바늘을 이용하여 관류 용액으로 관류 채널을 채운다. </li><li> 열교환 블록 옆 시험편 홀더를 전송하고 시험편 홀더 (도 1D)에 대한 입력 및 출력 관류 라인을 연결한다. (상부 전극 증폭기 접지 / 마이너스 핀에 연결) ERG 증폭기에 전극을 연결하는 어댑터를 사용하여 표본 홀더에 자극기 / 제어 유닛을 부착하거나 따라 자극 부에 가열 패드를 밀어 생체 내에서 그 위에 에르그 시스템이 사용됩니다. </li></ol> 3. 녹음 <ol><li> 생체 시스템의 소프트웨어를 사용하여 앰프와 자극 설정을 구성합니다. 300 Hz로 필터링 1 ~ 10 kHz와 로우 패스 사이의 값으로 인수 주파수를 설정합니다. 하이 패스 필터링을 사용하지 마십시오. 60 Hz에서 (또는 유럽에서 50 Hz에서) 필요한 경우 필터를 홈을 사용합니다. </li><li> 빛 자극과 재치없이 기록 기준시간 희미한 자극 (예., -35 dB의 0.3 MCD의 SM -2의 녹색 빛) 전극과 망막 샘플 사이 좋은 전기적 연결을 테스트합니다. 망막 온도 함수 안정된 상태에 도달하도록 데이터 수집을 시작하기 전에 20 분 - 10 기다린. <ol><li> 특정 실험에 따라 자극 파라미터를 선택하고 데이터 수집을 시작합니다. 예를 들면, 0dB까지 0.1 1,000까지 MCD의 SM에서 -40에서 녹색 빛을 사용 -2 암순응 응답 가족을 위해. 봉 배경 빛에 의해 억제 할 필요가 포토 픽 녹음에 약 2 밝은 로그 단위 3 깜박 사용 (3-30 CDM -2) 또는 프로브 플래시 (-2 = 1dB 약 1.3 카드뮴 SM을, 그림 3 참조). </li><li> 그러나 정확한 빛의 강도 값이 시스템 교정 및 실험 조건에 다소 의존 할 수 있음을 기억하십시오. 경험적으로,도 5에 의해 다운 스케일 강도 - 10 배는 생체에 비해 </eM&gt; 녹음 녹색 빛 (17)를 사용하여. (상업적 어댑터 시스템에 포함) 망막 위의 개구를 가진 블랙 커버 시험편 홀더에 광 산란을 감소시키고 시스템이 생체 내에서 상용의 Ganzfeld 구함으로써 두 망막의 균일하고 동일한 자극을 용이하게하는데 사용될 수있다. 참고 : 어두운 적응 망막에서 녹음 들어, 일반적인 실험 표백제 안료의 무시할 부분에 사용되는 테스트 깜박의 강도가되도록 망막 색소 상피 중심의 재생의 부족은 문제가되지 않습니다. 또한, 이전에 콘 안료 재생 여전히 뮐러 세포주기 (20)를 통하여 시각적 절연 망막에서 일어날 수 있음을 보여왔다. </li></ol></li><li> 실험은 몇 시간에 30 분부터 일반적으로 마지막으로 이러한 변화는 기술적 인 문제를 나타낼 수로, 실험 기간 동안베이스 라인 드리프트, 소음 및 응답의 안정성을 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : 노이즈 증가 또는 감소D 응답 진폭은 공기 관류 또는 전극 채널 거품, 너무 낮거나 높은 온도, 용액 누출 / 유출 또는 망막의 변위를 표시 할 수있다. </li></ol> 4. 청소 <ol><li> , 관류 라인으로부터 시험편 홀더를 분리하여 열고 여과지로부터 망막 플러시. 전극을 제거하고 증류수 (에탄올을 사용하지 않는)로 씻어. 에탄올 및 / 또는 증류수 (관류 채널 포함) 시편 홀더를 청소합니다. 조심스럽게 세척 관류 관 70&gt;와 % 에탄올. </li><li> 증류수 (세제를 사용하지 마십시오)와 관류 병을 씻어. 에탄올과 같은 병을 세척하기 위해 사용될 수있다. </li></ol>

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세인트 루이스의 워싱턴 대학은 Xenotec, 사와 라이센스 계약을 가지고 있으며, 생체 어댑터의 판매 로열티를받을 수 있습니다.

<html> 우리는 여기서 생체 ERG 어댑터와 함께 생체 ERG 시스템 구성 요소를 사용하여 두 개의 격리 된 마우스의 망막 동시에 고품질 생체 ERG 녹화를 얻기위한 중요한 단계를 보여준다. 본 연구에서 우리는 동일한 용액 (어느 에임스 &#39;, 로크 또는 링거)과 동물 모두에서 망막 관류하지만 약물 테스트를 위해 상이한 솔루션 등 각 망막 관류하는 것도 가능하다. 고품질의 데이터를 획득하기위한 가장 중요한 단계는 고급 맞춤형 시편 홀더를 사용하고 희미한 적색 (또는 IR) 하에서 모든 샘플 준비 절차를 수행하여 전자 노이즈, 망막주의 해부 안정적인 비교적 빠른 관류 흐름으로부터 차폐되고 빛. 여기에 설명 된 방법은 생체 내 및 생체 외 망막 전위도 녹음에서 수행하는 두 망막 및 생체 내 망막 전위 설정의 이중 사용을 즉시 사용할 수 있습니다. _content &quot;...

전위도 (ERG)은 빛에 의해 트리거 망막의 전기 활동을 기록 할 수있는 잘 확립 된 기법이다. ERG 신호는 망막의 세포 외 공간 저항에 흐르는 전류에 의한 방사 전압 변화 (감광체 바이폴라 셀의 축 방향)에 의해 주로 생성된다. 제 ERG 신호 은점 (1)의 표면으로부터 그렌에 의해 1865 년에 기록되었다. Einthoven 유쾌한 1908 2 B-, A-라는 세 가지 파도에 빛의 발병 ERG 응답, 및 C 파 지금 쌍극 세포, 감광체 주로 활동을 반영하는 것으로 알려져 있으며, 색소 상피를 분리 세포, 각각 3-8. 에르그 지역 (미소 전극과 (생체) 고립 그대로 망막에 걸쳐, 고립 된 눈 준비 (9)에서, 마취 동물 또는 (생체 내) 인간의 눈에서 3,10-15 또는에서 특정 망막 층을 기록 할 수 있습니다ERG) 4,16. 이들 중에서, 생체 ERG 현재 망막 기능을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 또한 진단 목적으로 이용 될 수 있거나 또는 동물이나 환자의 망막 질환의 진행을 따라 비 침습적 방법이다. 그러나 생체 내 에르그 녹음은 종종 안구 생리 소음 (예, 호흡과 심장 활동)에 의해 오염, 여러 중복 구성 요소와 복잡한 신호를 생성한다. 로컬 ERG는 망막의 특정 층에 걸쳐 신호를 기록하기 위해 사용될 수 있지만, 가장 침습적이고 다른 ERG 기록 구성과 비교하여 낮은 신호대 잡음비 (SNR)를 갖는다. 지역 망막 전위도 기술적으로 요구하고 고가의 장비 (예를 들어, 현미경과 미세 조작기)가 필요합니다. 그대로 고립 된 망막에서 Transretinal ERG (생체 ERG)는 안정적이고 HIG을 허용 생체 내 및 지역 에르그 방법 사이의 타협을 제공합니다동물이나 인간 (17)의 손상 망막에서 시간 SNR 녹음. 최근에,이 방법은 포유 동물, 영장류 및 인간 망막 18-20에 막대와 콘 감광체 기능을 연구하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 또한, 인해 생체 망막 색소 상피 세포의 부재로, ERG 신호의 포지티브 형 C 파 성분을 제거하고 눈에 띄는 네거티브 느린 PIII 성분은 생체 녹화 드러난다. 느린 PIII 성분은 망막 21-23에서 뮐러 아교 세포의 활성에서 발생하는 것으로 나타났다. 따라서, 생체 외 ERG 방법도 그대로 망막 뮐러 세포를 연구하기 위해 사용될 수있다. 여러 연구는 또한 생체 ERG 레코딩은 망막 (24) 주위되는 약물의 농도를 측정하고, 약 25 ~ 27의 안전성과 효능을 테스트하는 데 사용될 수 보여 주었다. 생체 시스템의 여러 상업이 가능하며,반드시 광범위한 전기 생리학 배경이없는 많은 실험실에서 사용. 대조적으로, 체외 장치 (17)는 최근까지 극소수 실험실은이 강력한 기술을 활용되는 결과로서 사용할 수 없었다. 그것은 망막의 생리와 병리에 대한 우리의 지식을 향상하고, 질병을 눈부신에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위해 더 많은 실험실에 생체 에르그 녹음을 사용할 수 있도록하는 것이 도움이 될 것입니다. 우리는 여기에 간단하고 저렴한 생체 ERG 장치 (17)을 설명하고는 일단이 상기 조작 패널 및 원뿔 - 매개 신호를 기록하는 몇몇 시판 생체 ERG 시스템과 조합하여 사용될 수있는 방법을 보여준다 (A- 및 B- 파)와 함수 그대로 야생형 마우스 망막에서 뮐러 세포 (PIII을 느리게).

<table><tbody><tr><td>생체 내 ERG 시스템</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>생체 내 ERG 시스템</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex vivo 어댑터</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG 어댑터</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">모든 브랜드</a></td></tr><tr><td>IR 이미터</td><td>Opto Diode Corp.</td>를 사용할 수 있습니다.<td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler 야간 투시경 스코프</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>군용 제품.</td></tr><tr><td>레드 필터</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>IR 시스템 대신 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>레드 헤드 라이트</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</a></td></tr><tr><td>pH 측정기 및 전극</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>모든 브랜드를</td></tr> <tr><td>사용할 수 있습니다.NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M 솔루션</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M 해결책</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>모든 브랜드를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>모든 브랜드</td></tr><tr><td>Ames 매체</td>를 사용할 수 있습니다 <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>사용할 수 있습니다 모든 브랜드</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td> 모든 <td>브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>숙신산 디소듐 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>모든 브랜드</td></tr><tr><td>L-글루탐산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>사용 가능</td></tr><tr><td>모든 브랜드 D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td> 모든 <td>브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>Leibovitz 배양 배지 L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>모든 브랜드</td></tr>의 <tr><td>MEM 비타민</td>을 사용할 수 있습니다 <td>: Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM 아미노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5 % CO2</td></tr></tbody></table>

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

생체 내 망막 전위측정(ERG) 신호는 서로 다른 망막 세포 유형에서 비롯된 여러 중첩 구성 요소와 망막 외 소스에서 발생하는 잡음으로 구성됩니다. 생체 전 ERG는 동물 또는 기증자 눈의 손상되지 않은 고립된 망막에서 직접 망막 세포의 기능을 절개하는 효율적인 방법을 제공합니다. 또한 생체 외 ERG는 동물 또는 인간의 망막 조직에 대한 잠재적 치료제의 효능과 안전성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 상업적으로 이용 가능한 생체 내 ERG 시스템을 사용하여 분리된 마우스 망막에서 생체 외 ERG 기록을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 표준 생체 내 시스템의 광 자극, 전자 및 가열 장치를 맞춤형으로 설계된 표본 홀더, 중력 제어 관류 시스템 및 전자기 노이즈 차폐와 결합하여 상업용 생체 내 컴퓨터에 포함된 수집 소프트웨어와 함께 두 개의 망막에서 저잡음 ex vivo ERG 신호를 동시에 기록합니다 시스템. 또한, 특정 망막 세포 유형의 기능을 해부하기 위해 특정 ERG 성분을 제거하는 약물 치료와 함께 이 방법을 사용하는 방법을 보여줍니다.

우리는 암순응 야생형에서 플래시 응답을 기록 실험 프로토콜 표준 관류 다른 해결책 (도 2)를 사용하여 상술 한도 1에 도시를 수행하여 (WT) C57BL / 6 마우스의 망막. 응답 파형과 반응 속도뿐만 아니라로드 광 수용체의 민감도는 에임스 &#39;와 로크의 미디어 (그림 2A와 B)에서 유사 나타났다. 한편, HEPES 완충 링거액 (NO 중탄산염 또는 5 % CO 95분의 2 %의 O 2)에 따라 응답 진폭이 상당히 작았 다. 우리는 또한 이러한 조건에서 B 파 안정성이 손상되었음을 발견했다. 40 μM의 지명 수배를 추가 (DL-AP4)의 세 가지 미디어 (그림 2D-F)에 효율적으로 긍정적 인 B 파를 제거했습니다. B 파의 제거는 뮐러 세포의 활동 (21)에 기인 한 큰 느린 음의 (그림 2D)를 밝혔다....

Ex vivo ERG는 동물 또는 인간의 분리된 온전한 망막에서 직접 망막 세포의 전기 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 망막 세포의 전기적 활동을 해부하기 위해 생체 외 ERG 기록에 일반적인 생체 내 ERG 시스템을 적용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

이 절차의 전체적인 목적은 상용 in vivo 망막전위도(electroretinogram, ERG) 시스템과 ex vivo 어댑터를 사용하여 분리된 마우스 망막 세포의 기능을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 양쪽 눈에서 망막을 절제함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 망막의 광수용체 층이 위로 오도록 시료 홀더에 장착하는 것입니다.다음으로, 시료 홀더를 in vivo ERG 시스템의 가열판 위에 놓고 중력 제어 관류 장치에 연결합니다. 마지막 단계로 시료 홀더의 전극을 증폭기에 연결하고, 망막에 빛 자극을 주어 ERG 반응을 얻습니다. 최종적으로, ex vivo ERG를 통해 약리학 및 특수 빛 자극 프로토콜을 사용하여 간상세포 및 원추세포 매개 신호 전달 경로를 어떻게 분석할 수 있는지 보여줍니다.in vivo, ERG 또는 단일 세포 기록과 같은 다른 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 더 높은 신호 대 잡음비를 제공하며, 더 길고 안정적인 기록이 가능하고, 쉽고 정량적인 약리학적 조작이 가능하다는 점입니다. 또한, 이 방법은 영장류 및 인간 기증자 망막에서 망막 질환 치료를 위해 설계된 약물의 효능과 안전성을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 최소 하루 전에 돔 상단에 흑회색 필터지를 붙여 시료 홀더의 바닥 부분을 수정하십시오. 돔의 가장자리를 따라 2성분 5분 경화 에폭시를 사용하고, 필요한 경우 해부 현미경을 사용하십시오. 접착제가 마른 후, 필터지를 돔에 밀착시켜 평평하게 누르십시오.이는 약 한 달 정도의 기록 기간 동안 유효합니다. 그 후 종이를 제거하고 돔을 70% ethanol로 세척하십시오. 이제 전극을 준비하기 위해, 먼저 전극 채널을 전극 용액으로 채웁니다.기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 펠릿 전극을 전극 채널에 나사로 고정하십시오. 시편 홀더의 상단과 하단 조각을 4개의 나사로 연결하고 관류 라인에 전극 용액을 채우십시오.다음으로, 전극 쌍의 리드 사이의 저항과 전압을 측정합니다. 저항은 100 kilo ohms 미만이어야 하며, 전압은 10 millivolts 미만이어야 합니다. 채널에 기포가 없고 전극 상태가 양호하다면, 샘플 관류를 위해 유리 병에 400 to 700 milliliters의 관류 배지를 붓습니다.또한, 해부를 위해 300 milliliters를 따로 따라내어 냉장고에 보관하십시오. 그런 다음 관류 튜빙을 열교환 블록에 통과시키고, 예열된 블록을 가열판 위에 놓으십시오. 이제 가스 입구와 관류 튜빙 입구가 있는 캡으로 병을 밀봉하십시오.가스 입구는 에어스톤에 연결해야 합니다. 관류 배지가 37 °C로 유지될 예열된 병을 배치하십시오. 그 다음, 관류 라인에 관류 배지를 채워 프라이밍함으로써 ocus science 시스템에서 중력 구동 흐름을 개시하십시오.노이즈를 최소화하기 위해 병을 패러데이 케이지(Faraday cage) 내부에 두고, 시료 홀더로부터 긴 관류 출력 라인을 사용하십시오. 시료 홀더 및 관류 병의 높이보다 훨씬 낮게 배치된 이 출력 라인들을 차폐하고, 차폐물을 패러데이 케이지를 통해 증폭기의 접지에 연결하십시오. 전자기 노이즈가 ERG 신호에 결합되는 것을 방지하기 위해, 온도 프로브를 가열 스테이지에 부착하십시오.이제 조절기를 사용하여 용액 유량을 분당 3~5 mL로 조정하십시오. 마지막으로, 필요한 경우 용액에 CO₂ 및 O₂ 가스를 주입하고 조절기를 조정하여 에어스톤에서 기포가 일정하게 나오도록 합니다. 먼저 대형 페트리 접시에 차가운 관류액 약 200 mL를 부어 시료 홀더의 바닥 부분이 완전히 잠길 수 있도록 합니다.12시간의 명암 주기로 사육된 동물을 안구 기록 전 6~12시간 동안 암적응시킨 후 안락사시킵니다. 다음의 모든 절차는 어두운 적색광 또는 적외선 조명 하에서 수행해야 합니다. 각 안구를 분리한 후, 안구 배지에 넣습니다.그런 다음 안구 하나를 종이 위에 놓인 작은 필터 페이퍼 조각으로 옮깁니다. 핀셋으로 잡고 aura serrata와 거의 동일한 높이의 절개선을 냅니다. cornea와 lens를 제거하기 위해 aura serrata를 따라 또는 적도에 더 가까운 곳을 절개합니다.그런 다음 각막과 수정체 끝부분을 제거하고 안구 컵을 다시 냉각 배지로 옮깁니다. 반대편 눈에도 동일한 절차를 반복합니다. 이제 안구 컵의 상단에서 시신경 방향으로 작은 절개를 만듭니다.망막이 최대한 온전하게 유지될 수 있도록 가위를 망막과 공막 사이에 위치시킵니다. 그다음, 두 개의 핀셋을 사용하여 절개 부위 양측의 공막을 잡고 조직을 벌려 망막을 분리합니다. 망막을 분리하기 위해 시신경을 절단하고, 망막의 원위 표면과의 접촉을 최소화하면서 망막을 제거합니다.이제 분리된 망막을 시료 홀더의 돔 위에 고정합니다. 먼저 시료 홀더의 하단부를 적출된 망막이 들어 있는 페트리 접시에 담그십시오. 다음 슬라이드입니다.망막 광수용체 또는 볼록한 면이 위로 향하도록 돔 위에 놓습니다. 그런 다음 시료 홀더를 조심스럽게 들어 올려 망막이 여과지에 부착되도록 합니다. 이후 다른 쪽 망막에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다.이제 크로스토크 노이즈와 신호 션팅을 방지하기 위해 홀더 플레이트를 조심스럽게 건조하십시오. 홀더를 건조한 후 상단 부분을 나사로 조이고, 주사기와 바늘을 사용하여 관류 채널을 관류액으로 채웁니다. 시료 홀더를 열교환 블록 옆에 배치하십시오.그 다음, 입력 및 출력 관류 라인을 연결합니다. 전극을 ERG 증폭기에 연결하고 자극기 제어 장치를 시료 홀더에 부착하여 설정을 완료합니다. 크고 재사용 가능한 반응을 얻기 위해서는, 데이터 수집 전 망막을 정밀하게 박리 및 고정하고 망막 상단에 기포가 없는 안정적인 관류 상태를 유지하는 것이 중요합니다.망막의 온도와 기능이 안정화될 때까지 10~20분 동안 기다립니다. 암적응된 야생형 C 57 black six 망막에서 서로 다른 표준 관류액을 사용하여 플래시 반응을 기록했습니다. 반응 파형과 키네틱은 Ames 배지와 Locke 배지에서 유사하게 나타났습니다. 간상 광수용기의 민감도 또한 유사했습니다.반면, 중탄산염이나 카보젠 반응이 없는 Heaps buffered ringer 용액에서는 진폭이 유의하게 더 작았습니다. Heaps ringer에서는 BWA 안정성 또한 종종 저하되었습니다. 40 µM의 APB를 첨가하면 양성 B파가 효율적으로 제거되었습니다.이를 통해 뮬러 세포(Mueller cell) 활성으로 인한 것으로 알려진 크고 느린 음성 파형이 나타났으며, 100 µM의 바륨(barium)을 추가하여 이를 제거했습니다. 이 성분은 ex vivo ERG 신호의 광수용체 반응을 나타냅니다. 이 방법은 약리학 및 유전학 등의 다른 도구와 결합하여, 인간을 포함한 포유류 망막의 망막 신호 전달의 분자적 기전 및 실명 질환에 관한 질문에 답하는 데 활용될 수 있습니다.

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

multifocal electroretinogram (mfERG)의 개발 망막 병증의 진단 및 특성화의 중요한 사전이다. Multifocal electroretinograms는 B - 파도의 근사치의 수학적 평균입니다. 소프트웨어 프로그램은 눈 당 몇 분 이상의 백 망막 지역에서 ERGs를 파생하실 수 있습니다. Scotomas 및 망막 장애가 매핑과 계량 수 있습니다.

Multifocal Electroretinograms

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

이 비디오는 의식이 있는 쥐의 망막전도(ERG)와 시각 유발 전위(VEP)를 기록하는 방법을 보여줍니다. 외과적으로 전극을 이식한 쥐는 먼저 어둠에 적응한다. 확장 점안액을 적용한 후, 동물을 구속기에 넣고 Ganzfeld 그릇에 넣습니다. 그런 다음 ERG 및 VEP 신호가 기록됩니다.

쥐의 망막전도 및 시각 유발 잠재력 기록

망막전위도(ERG)는 빛에 반응하여 망막에서 생성되는 전위입니다. 이 논문은 어둡게 적응한 쥐에서 ERG를 사용하여 망막 기능을 평가하는 방법과 신경 보호 중재(현재의 경우 원격 허혈 전조건)를 평가하는 데 ERG를 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.

쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

이 프로토콜은 마취된 쥐에서 망막전도와 시각적 유발 전위를 동시에 측정하는 것을 설명합니다.

전위도의 동시 녹화 및 마취 된 흰쥐의 비주얼 사건 관련 전위

여기서, 우리는 2000년대 초에 Marmorstein, 복숭아 및 동료에 의해 처음 기술된 DC-ERGs로 알려져 있는 기술을 사용하여 마우스에서 망막 안료 상피(RPE)의 광유발 전기 반응을 기록하는 방법을 제시한다.

마우스 망막 안료 상피의 빛 방출 전기 응답 기록을 위한 직접 결합 된 전기 전체노그램 (DC-ERG)

국제 표준을 준수하고 망막 어두운 적응을 유지하는 것은 상속 된 망막 질환의 진단 및 관리에서 유효한 전야 전소 전기 전세 음법 반응을 얻는 데 중요합니다. 수술실 환경에서 시트또는 전신 마취 하에 유아와 어린이를 위한 전야 전세 전세전전도를 얻기 위해 휴대용 암실을 사용하는 실용적인 프로토콜이 제공됩니다.

최적의 어두운 적응 및 국제 표준을 달성하기 위해 마취 하에 유아와 어린이를위한 전기 전도소 기록

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

기존 다중 전극 어레이 또는 패치 클램프 장비를 수정하면 생체 외 망막전전도에 더 널리 접근할 수 있습니다. 생체 외 광 반응을 기록하고 유지하는 개선된 방법은 건강한 망막, 안과 질환의 동물 모델 및 인간 기증자 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 기능의 연구를 용이하게 합니다.

작고 큰 눈의 망막 기능을 연구하기 위해 생체 외 망막 전도의 설정 및 조건 최적화

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

학습하세요 생체 외 전기망막도(ERG)를 이용해 격리된 쥐 망막의 세포 기능을 평가하는 방법을. 약리학적 기법으로 막대세포와 원추세포 신호 전달 경로를 분석하여 망막 생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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