Name: Modelos distintivo ação capilar por micro-canais em Osso-como pode aumentar o recrutamento de células para a Restauração da Grande Bony Defeito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a criar modelos ósseos com microcanais que aumentam a absorção e retenção celular por ação capilar. Esta técnica utiliza esponjas de poliuretano revestidas com hidroxiapatita para regeneração de defeitos ósseos cranianos e maxilofaciais.

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Os autores não têm agradecimentos.

1. Poliuretano (PU) Sponge Preparação como Modelo <ol><li> Use esponjas PU para produzir modelos de hidroxiapatita contendo poros comunicantes. Usar cada esponja para fornecer as trabéculas primária para a formação das escoras do molde, bem como a formação de micro-canais dentro de trabéculas. </li><li> Cortar e aparar 80 ppi (poros por polegada) esponjas em 2 ponte-formas com dimensões de 3,5 cm de altura x 5 cm de comprimento x 1,5 cm de largura. Nota: As dimensões e formas podem ser escolhidas de acordo com o tamanho de poro desejado primária: 100 ppi, 80 ppi e 60 ppi. </li><li> Adicione 100 ml de 4% (w / v) de uma solução de NaOH utilizando um copo de 150 ml; em seguida, mergulhar e espremer até que as esponjas preparadas são completamente encharcada. </li><li> Após a imersão, coloque o copo com as esponjas do ultrasonicator (42 kHz). </li><li> Ultrassonicamente pré-tratar as esponjas de PU para 15-20 min sem calor para modificar as propriedades de superfície. </li><li> Enxágüe com água destiladaágua para 5-10 min. Ao lavar, apertar as esponjas e permitir-lhes expandir 5 a 7 vezes a fim de remover o NaOH residual no interior das esponjas. </li><li> Espremer as esponjas com toalhas de papel, a fim de remover o excesso de água; em seguida secá-los num forno a 60-80 ° C. </li></ol> 2. A hidroxiapatita (HA) Slurry Preparação para Revestimento <ol><li> Antes de fazer a suspensão de HA, medir o peso de um copo com uma barra de agitação magnética. Esta medição vai ser utilizado para calcular a relação pó / líquido. </li><li> Medir 10 g de HA em pó tamanho nano. </li><li> Adicionar 20 ml de água destilada no copo de 50 ml. Calor para 120-140 ° C e agitar com um agitador magnético placa quente. </li><li> Adicionar 0,3 g (3% w / w) de álcool polivinílico (PVA) (MW 89,000-98,000) por pó em água destilada com agitação a 300-400 rpm. </li><li> Agita-se até o PVA estar completamente dissolvido. A solução deve ser límpida após a dissolução completa do PVA. </li><li> Vire off o calor e adicionar 0,1 g (1% w / w) de carboximetilcelulose de sódio (CMC) (ultra-baixa viscosidade) em pó enquanto se agitava a 400-500 rpm. A solução deve ser límpida após a dissolução completa do PVA. </li><li> Mexa até que o CMC se dissolva completamente e arrefecer à RT. </li><li> Adicionar 0,3 g (3% w / w) de dispersante de poliacrilato de amónio em pó por agitação a 300-400 rpm. Mexa até dissolver completamente. </li><li> Adicionar 0,2 g (2% w / w) de glicerina por pó enquanto se agitava a 300-400 rpm. Mexa até dissolver completamente. </li><li> Lentamente dispersar o pó de HA na solução enquanto se agitava a 600-900 rpm e manter a agitação durante 5 min. </li><li> Sonicar durante 5 min, utilizando um ultrasonicator para assegurar a dispersão de qualquer aglomeração do pó de HA. </li><li> Adicionar um extra de 5 ml de água destilada para dentro da mistura com agitação a 600-900 rpm e aquece-se a 90-100 ° C. </li><li> Continuar a mexer a mistura utilizando um agitador magnético a 600-800 rpm, a 90-100 ° C em order para evaporar o conteúdo de água. </li><li> Medir o peso inteiro, incluindo o recipiente e mistura ao longo do tempo até uma razão de pó / líquido de 1,75-1,8 é obtido. </li><li> A formatação da relação pó / líquido, dividir a massa do pó e o peso total da mistura (2,14), incluindo o pó, reagentes, e de água, menos o peso da taça e um agitador (2.1), e menos o pó de HA (2.2). Nota: Por exemplo: Se A (mistura em pó inteiro, incluindo, reagentes, e da água) é 49,05 g, B (proveta com agitador) é de 33,5 g, e, em seguida, C (HA pó) é de 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Permitir que a suspensão arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilizar para revestimento. </li></ol> 3. HA revestimento, secagem e sinterização <ol><li> Revestir as esponjas preparadas de PU com a suspensão de revestimento de HA utilizando uma espátula de aço inoxidável até a suspensão é homogeneamente distribuído em toda a esponja de PU numa placa de vidro. Nota: Depois de retirar o excesso de injúriary, alguns dos poros ainda pode ser obstruído com pasta devido à alta viscosidade da lama. </li><li> De modo a assegurar a interligação, a uniformidade, e os poros abertos, ligeiramente soprar os modelos HA revestida utilizando um compressor de ar. Este processo garante que os moldes estão homogeneamente revestido tanto nas superfícies interiores e exteriores da esponja de PU. Nota: Se um revestimento homogéneo não é alcançado, os modelos revestidos HA entrará em colapso durante o processo de sinterização e também podem quebrar durante o manuseio devido à baixa resistência mecânica. Além disso, o revestimento homogéneo é crítico na criação de micro-canais dentro de trabéculas. </li><li> Secam-se os modelos de HA revestidas durante um mínimo de 5 horas, sob condições de arrefecimento (20-25 ° C) com circulação de ar suave. No entanto, prolongar o tempo de secagem com base no tamanho do molde. Nota: Após a secagem, os modelos revestidos HA irá encolher tipicamente cerca de 8% a 10% em cada dimensão. </li><li> Após o processo de secagem, colocar o HAmodelos revestidos de um cadinho de alumina. Em seguida, colocá-los em um forno de alta temperatura e usar o 8 passo seguinte perfil sinterização. <ol><li> Calor de 2 ° C / min até 230 ° C. </li><li> Calor 1 ° C / min até 280 ° C. </li><li> Aquecer 0,5 ° C / min até 400 ° C. </li><li> Calor 3 ° C / min até 600 ° C. Mantenha a 600 ° C por 1 hora. </li><li> Aquecer 5 ° C / min até 1230 ° C. Manter 1230 ° C durante 3 h. </li><li> Arrefecer 5 ° C / minuto até à temperatura ambiente. Nota: a sinterização irá reduzir ainda mais os modelos de esponja revestidas por HA de cerca de 22% - 25% em cada dimensão. </li></ol></li></ol> 4. Ingress e inhabitancy de células em Template <ol><li> Culturas de células MC3T3 pré-osteoblásticas em um meio não-osteogénica que consiste em α-MEM, suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de antibióticos (estreptomicina e penicilina) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2 . </li><li> Adicionar 10 mlde uma suspensão de células a 2 x 10 6 a densidade celular em uma única bem dentro de uma placa de 6 poços. </li><li> Coloque o molde em forma de ponte de 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente na placa de 6 poços. Coloque uma perna do modelo na placa que contém a suspensão de células, e a outra perna num poço vazio adjacente. </li><li> Permitir que o molde para absorver a suspensão de células durante 10 min. </li><li> Adicionar 5 ml de meios em seguida para o poço que foi inicialmente cheio com a suspensão de células. </li><li> Reabastecer o meio em ambos os poços cada 2 ou 3 dias até 7 dias se passaram. </li><li> Determinar a eficácia da mobilidade celular por hematoxilina e eosina 11. <ol><li> Fixar as células e andaime por imersão em EtOH a 100% por 20-30 min. </li><li> Mancha com hematoxilina para 1-2 min. </li><li> Enxágüe com água destilada por 1-2 min por duas vezes. </li><li> Desidratar por imersão em 70%, depois 95%, depois 100% de EtOH durante 1-2 min cada. </li><li> Coram com eosina por 20-30 seg. </li><li> Enxágüe com água destilada por 12 min para o dobro. </li><li> Desidratar por imersão em 70%, 80%, 90%, e 100% de EtOH durante 1-2 min cada. </li><li> Incorporar o andaime em uma resina acrílica para seccionamento e de imagem. </li></ol></li><li> Determinar a viabilidade celular, com o ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio (MTT) a viabilidade celular e ensaio vivo / morto (células vivas / mortas kit de coloração com MPTP) no tempo de pontos do dia 3 e 7 11. Nota: O esquema de protocolos de fabricação do modelo de osso-como são representados no &quot;Resultados representativos&quot; sessão. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um molde de multi componente incluindo células, factores de crescimento, nutrientes, etc, é necessária para a regeneração do osso bem sucedida e restauração funcional de grandes defeitos ósseos críticos de tamanho. Dentro desses fatores, propriedades biológicas anatomicamente conformes são essenciais. Para realizar a funcionalidade biológica, o molde deve apresentar biocompatibilidade, osteocondutividade, integridade mecânica, uma superfície, uma textura de superfície adequada, e os meios para o transporte de oxigénio e de nutrientes. Ao nível celular, as seguintes características são especialmente crucial para a restauração funcional de defeitos ósseos maciços: penetração facilitado em modelo (recrutamento activo), a distribuição uniforme em todo o modelo (retenção), a proliferação acelerada e alta viabilidade (habitação). Finalmente, a formação subsequente de matriz extracelular substancial e o desencadeamento de expressão do gene são cruciais em processos biológicos essenciais, tais como uma rápida vascularizaçãoosteogênese nd. Muitos tipos diferentes de substitutos sintéticos têm sido propostos para substituir auto- / alo- enxertos ósseos. No entanto, a organização andaime actual não exibem um microambiente interno contendo micro-canais e nano-poros, e tem, portanto, não activamente facilitar a infiltração celular, distribuição, e inhabitance em profundidade os substitutos sintéticos que são maiores do que 10 mm. Eles não fornecem pistas físicas para abrir caminho para as células de forma eficiente, rápida e uniformemente migrar profundamente o modelo de osso. Em vez disso, o recrutamento de células passiva limitado cria uma populações de células desigualmente distribuídas entre as zonas exteriores e interiores do andaime. Isto não só agrava o desafio inicial das células que atingem o núcleo interno da matriz, mas também impede o fluxo de nutrientes e comunicação celular com a outra extremidade do substituto sintético. Este tipo de resultados de recrutamento e Habitacionais celulares desproporcional na célula death e crescimento incompleto do osso depois de a escora tenha sido implantado no corpo 14,15. Assim, nós introduzimos o conceito de ação capilar como a sugestão físico primário para superar estes obstáculos. Temos absolutamente de engenharia micro-canais na BMT para induzir a ação capilar que serão responsáveis ​​por a força de arrasto principal responsável para recrutar células profundas na BMT. A técnica de revestimento de esponja PU apresenta várias propriedades únicas. Em primeiro lugar, permite uma fácil preparação das estruturas porosas trabecular bem controlados, que se dependem das estruturas do molde pré-definido (ou seja, 80 poros por polegada molde para 300-400 mm). Isto é muito importante para a optimização de tamanho de poro de 15 osteoblastos infiltração. Em segundo lugar, a técnica permite a construção de micro-canais interligados, que representam o papel significativo de inicializar deslocalização da célula 11. Em terceiro lugar, quase não há limitações ao usar a esponja PU em termos de criação de formas e tamanhos dos modelos personalizados. O fabricante pode usar uma tesoura para formas simples ou até mesmo de corte a laser computadorizada para geometrias complexas. Usando essas tecnologias precisamente controladas, criamos o TMO. HA foi seleccionado como o material de partida, devido à sua biocompatibilidade e capacidade osteocondutora 17. Neste estudo, existem vários passos críticos que precisam ser destacados. Durante a preparação das suspensões de HA, se a temperatura for demasiado elevada e a velocidade de agitação é demasiado baixa, a suspensão de HA vai ficar preso na extremidade inferior do recipiente e secar. Após o processo de revestimento, quando se sopra para fora o excesso de pasta fluida HA, demasiado elevada de uma pressão de ar pode induzir fissuras na superfície do TMO. É importante manter a pressão de ar relativamente baixo para expor adequadamente o excesso de pasta fluida HA única. Finalmente, os segundo e terceiro passos do processo de sinterizaçãosão mais crucial (calor 1 ° C / min até 280 ° C e calor de 0,5 ° C / min até 400 ° C). Neste intervalo de temperatura, a esponja PU vai queimar completamente fora enquanto o HA torna-se densa. Se este protocolo não é seguido de perto, o TMO será recolhido ou se desintegrou após a sinterização. O TMO descrito no presente estudo oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, as macro-poros interconectados (300-400 um) imitam os de osso trabecular humano e permite o fluxo de medula óssea suave. Em segundo lugar, os moldes são constituídos por micro-canais (25-50 ^ m) em cada septo trabecular para acelerar a entrada inicial de células de osso através da acção capilar. Como demonstrado utilizando simulação computacional 13, se o modelo apenas 300 uM poros primários (poros) e não há microcanais, a acção capilar seriam insuficientes para a saturação completa do molde com medula óssea. Isso seria especialmente verdadeiro para grandes defeitos tamanho que exigiriam lmodelos de tamanho arge. Sized micrômetros de canais exibem absorção de fluidos altamente eficaz e, assim, esperava que os micro-canais a ser a principal responsável pela acção capilar em nosso estudo. Em terceiro lugar, os nossos BMTs foram estrategicamente colocados nano-poros. Dados da literatura indicam que as células são especialmente sensíveis à nano-padrões 18,19; portanto, esperado que os nano-poros nas paredes dos microcanais para desempenhar um papel no aumento da ligação de células. Poros de tamanho nano (100-400 nm) na superfície da septos trabecular permitidos para ancorar células imobilizadas. Em geral, os efeitos combinados destas três estruturas internas resultou na mobilização e adesão celular aumentada ao longo do molde. No entanto, existem algumas limitações do protocolo e os passos críticos para fabricar o BMT perfeito. Por exemplo, há muitas vezes uma grande quantidade de pasta fluida HA preparados, devido à dificuldade de manter uma viscosidade enquanto o revestimento homogéneo. Além disso, há uma limitação na tomadamodelos de mais de 5 cm 3 de volume devido ao tempo de trabalho, enquanto revestimento. A espessura do revestimento é crítico que varia de acordo com as técnicas do fabricante. Os resultados do nosso estudo sugerem que a BMT capaz de absorver e reter as células irão oferecer potenciais vantagens sobre andaimes alloplastic convencional (ou sintético). Um estudo prospectivo, está a ser considerado para verificar os benefícios da BMT na osteogénese e / ou angiogénese, juntamente com os factores de crescimento relacionadas com os ossos. Por isso, afirmamos que o nosso único destaque BMT andaime pode tratar das principais barreiras da infiltração da medula óssea insuficiente para as construções sintéticas e regeneração óssea incompleta em grandes defeitos. O objetivo final deste estudo é o de simplificar o paradigma atual de bioengenharia na reconstrução óssea e restauração funcional em defeitos ósseos de tamanho crítico, eliminando a necessidade de estroma da medula óssea tempo- / trabalho intensivoprocessos de células l de isolamento e expansão. Finalmente, pretendemos utilizar anatomicamente conformando-construções em 3D com micro-canais e nano-poros, que induzem uma rápida absorção celular, distribuição homogênea, e inhabitance para a reconstrução do osso.

O objetivo final da engenharia de tecido ósseo com construções sintéticas é a incorporação das construções no osso hospedeiro, repovoamento das construções com células hospedeiras e reconstituição de trocas de gases e fluidos corporais para restaurar a função óssea normal. Pesquisas consideráveis foram relatadas na última década no uso de biomateriais poliméricos e cerâmicos para a produção de andaimes1,2. No entanto, o material ideal e a técnica de fabricação para a regeneração ideal do tecido ósseo ainda não foram identificados. Além disso, há uma falta geral de sucesso em trazer essas tecnologias para a clínica, especialmente para a reconstrução e restauração de grandes defeitos ósseos. Portanto, restaurar defeitos ósseos de tamanho crítico ainda é um desafio clínico1-5. 
Idealmente, os andaimes para regeneração do tecido ósseo devem apresentar biocompatibilidade sem causar respostas inflamatórias ou reações tóxicas/corpo estranho, ter propriedades mecânicas semelhantes quando comparadas às do osso nativo e possuir um mecanismo para permitir a difusão e/ou transporte de íons e nutrientes. Forte ligação com o osso hospedeiro, crescimento ósseo dinâmico, crescimento vascular e biodegradação dos andaimes são igualmente desejáveis. Embora o uso de scaffolds poliméricos biodegradáveis tenha apresentado progresso em termos de crescimento tecidual, existem controvérsias sobre seu uso para regeneração óssea. 
Apesar desses esforços extensivos, as construções sintéticas estruturais altamente organizadas ainda têm potencial limitado para superar o obstáculo da penetração celular passiva. A maioria dessas abordagens resultou no crescimento do tecido in vitro com seções transversais de menos de alguns μm a vários mm da superfície externa, uma integração incompleta com o osso hospedeiro e apenas regeneração óssea parcial in vivo6,7. As células pioneiras não migram profundamente para as construções devido à falta de uma força inicial que as puxe para dentro antes do início da colonização celular. Consequentemente, a colonização celular ocorre estritamente na periferia do andaime, tornando-se uma obstrução da periferia para o centro do andaime. Assim, a difusão de oxigênio e nutrientes nas partes internas dos moldes torna-se limitada8. Portanto, fica claro que a arquitetura dos andaimes (tamanho dos poros, porosidade, interconectividade e permeabilidade) que afetam o transporte e a difusão de substâncias pelos andaimes é crítica para alcançar a proliferação e diferenciação celular bem distribuída9,10. Embora os fosfatos de cálcio tenham sido usados no passado para a fabricação de andaimes, diferentes processos e procedimentos muitas vezes resultaram em andaimes de fosfato de cálcio com arquiteturas variadas. Assim, a seleção do processo de fabricação torna-se importante para ditar a arquitetura do andaime necessária para a regeneração bem-sucedida do tecido ósseo.
Em conclusão, ainda existem duas grandes deficiências da engenharia de tecido ósseo que precisam ser abordadas: o recrutamento inicial de células para o molde antes da fixação e colonização da célula e a qualidade do fluxo de substância para dentro e para fora do molde.

<table><tbody><tr><td>esponja de poliuretano</td><td>Plastifoam</td><td>PU-3215</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>167176</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxiapatita em Pó</td><td>Ossgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool Polivinílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Carboximetilcelulose sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>poliacrilato de amônio</td><td>Vanderbilt</td><td>DARVAN 821A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2289</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos distintivo ação capilar por micro-canais em osso-como pode aumentar o recrutamento de células para a restauração da grande bony defeito

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Sem, uma população de células florescente activo que é bem distribuído e ancorado de forma estável com o molde inserido, a regeneração óssea excepcional não ocorre. Com os modelos convencionais, ausência de micro-canais internos resulta na ausência de infiltrado celular, distribuição, e inhabitance profundo no interior dos moldes. Assim, um modelo altamente porosa e uniforme interligado-trabecular de ossos como com micro-canais (modelo microambiente biogênicas; BMT) foi desenvolvido para superar estes obstáculos. O romance BMT foi criado por conceitos inovadores (ação capilar) e fabricado com uma técnica de revestimento de esponja-modelo. O TMO é composto por vários componentes estruturais: primário-poros interconectados (300-400 um) que imitam poros em osso trabecular, micro-canais (25-70 um) dentro de cada trabecula e nanoporos (100-400 nm) sobre a superfície para permitir que as células a ancorar. Além disso, o TMO tem sido documentada pelo estudo teste mecânico para ter simILAR propriedades de resistência mecânica às do osso trabecular humano (~ 3,8 MPa) 12. A BMT exibiu alta absorção, retenção e morada de células ao longo dos (¸) modelos em forma de ponte (de altura de 3 cm e 4 cm de comprimento). As células que foram inicialmente semeadas em uma extremidade dos modelos imediatamente mobilizados para a outra extremidade (10 cm de distância) por acção capilar do TMO no meio celular. Após 4 horas, as células homogeneamente ocupava todo o BMT e exibiu comportamento celular normal. A ação capilar representaram a infiltração das células suspensas na mídia e distribuição (migração ativa) durante todo o TMO. Tendo observado estas capacidades do TMO, projectamos BMTs que irá absorver células de medula óssea, factores de crescimento e nutrientes a partir da periferia em condições fisiológicas. A BMT pode resolver as limitações atuais via rápida infiltração, distribuição homogênea e inhabitance de células em grandes, modelos volumétricos para reparar defeitos esqueléticos maciças.

A estrutura geral do TMO exibe um modelo tridimensional original com estruturas internas do osso trabecular semelhante. A BMT contém macro-poros, micro-canais, e nano-poros. Configurações claras de totalmente interligadas macro-poros (tamanho médio de 320 mícrons), micro-canais (diâmetro médio de 50 mm), e nano-poros (tamanho médio de 100 nm) foram verificadas com um microscópio eletrônico de varredura (EVO-40; Zeiss), bem como através de micro-tomografia. A Figura 1 mostra protocolos detalhados passo a passo na criação de um TMO. Através de um controlo preciso dos protocolos de preparação das esponjas de PU para o processo de sinterização (P1 - P7; Figura 1), as características seguintes podem ser obtidos: uma superfície altamente denso e liso após o revestimento de HA e secagem; um precisamente moldada e dimensionada de 3-D do modelo; uma rede trabecular poroso completamente interligada semelhante à do osso trabecular; e micro-canais sagacidadehin cada trabecula que imitam canais intra-ósseos, tais como canais de Havers e canais de Volkmann (Figuras 2 e 3). Além disso, relativamente elevada resistência mecânica (~ 3,8 MPa) semelhante ao do osso trabecular humano foi medido por um teste de resistência à compressão. Altamente histomorfométricas parâmetros semelhantes com os da vértebra lombar humano osso trabecular foram confirmadas por análise de micro-CT 12. Diferentes magnitudes de ação capilar foram demonstrados através de diferentes diâmetros capilares na Figura 4, utilizando simulação computacional. Através destas simulações, projetamos que a BMT exibiria diferentes taxas de absorção dentro das primárias-poros (300-400 um) e micro-canais (25-70 um), com base nos diâmetros. Capilares menores exibiram capacidades de absorção fortes. Esta suposição foi verificada nesta experiência como demonstrado na Figura 5. O TMO exibiu altamente eficazabsorção e retenção de fluido através da acção capilar das estruturas micro-canal; mancha azul de Stevenel foi usado como meio de fluido para controlar facilmente o fluxo (Figura 5). Com base na simulação computacional, o TMO com estas configurações foram observados para absorver e reter suspensões de células de até 8,5 cm de distância total dentro de 10 seg. Devido a uma forte acção capilar induzida por as estruturas internas, a forma manchado atingido a extremidade oposta de um 3 cm (altura) x 4 cm (comprimento) x 1 cm (largura) do modelo em forma de ponte dentro de 1 min e 40 seg. Além disso, a mobilização de células activo e incorporação no TMO foi observado (Figura 6). Subsequentemente, a mobilização de células homogénea e fixação resultou na proliferação aumentada e a formação de matriz numa formação uniformemente distribuída. Além disso, a longa distância (~ 10 cm) migração de células através do TMO foi validada imediatamente após o TMO foi saturado com a suspensão de células. Se<html> EDED células sobreviveram no segmento modelo que foi exposta ao ar e não imersa no meio de cultura. Nesta experiência, o meio de cultura foi fornecido às células por exclusivamente nos poços que tocam apenas as pernas do andaime. A ação capilar exibida pelos microcanais em seguida deixada para meio fresco para alcançar a parte de cima, ponte do andaime. Após 3 dias de cultura, o modelo tornou-se ocupado com células de proliferação rápida. Após 7 dias de cultura, cada trabecula foi envolvido por matrizes extracelulares e incorporado com células 13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Figura 1. O protocolo de fabricação modelo global semelhante ao osso a partir do pré-tratamento de PU esponja (P1) para o tratamento térmico final (P7). Mantendo o perfil exacto de sinterização após P7 é crucial para alcançar resistência mecânica favorável.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Figura 2 microscópio estéreo Representante (AmScope; SM-2TZ-M) imagens (x4) de um ppi 80 dimensionada PU esponja (à esquerda), HA revestido e seco BMT (meio), e sinterizados BMT (direita) (Dimensão: 3. cm de altura x 4 cm de comprimento x 1 cm de largura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Imagens Figura 3. SEM e micro-CT de um modelo biogenic: (A) uma imagem global de um modelo biogênicas, <st<html> rong&gt; (B, C, D) imagens de micro-canais. A fim de destacar micro-canais claros no trabeculado, o modelo foi granulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Figura 4. cálculo computacional de acção capilar com diferentes diâmetros de canal dentro do mesmo período de tempo (0,4 ms), enquanto o maior capilar (d = 300 uM: refere-se ao primário de poros) absorvido a forma (azul) com 0,16 mm de altura, o menor capilar (d = 30 mm: refere-se a micro-channel) absorvida a médio até 0,415 mm de altura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figura 5. As imagens mostraram diferenças de capacidades de absorção de acção capilar com base em diferentes tamanhos de poros-primárias e micro-canais (tamanho de poros primária refere-se ao diâmetro médio: 60 ppi ≈ 470 uM, 80 ppi ≈ 320 mícrons, ≈ 100 ppi 200 um). As linhas amarelas representam a acção capilar induzida pela combinação de poros primários e micro-canais. As linhas vermelhas representam a ação capilar induzida principalmente por micro-canais exibidos em cada trabecula. Como mostrado em (F), o modelo 100 ppi induzida a acção capilar mais forte, o que resulta na saturação completa do molde dentro de 39 seg. Os modelos de 80 ppi e 60 ppi foram testados depois. (B) 0 seg, (C) 0,5 s, (D) 1,5 s, (E) 17,0 seg, (F) 39,0 seg, (L) 50,0 seg, e (H) 1 min 18 seg depois da imersão. (Dimensão Template: 1cm x 1 cm x 4 cm de altura cúbico). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Figura 6. A entrada e a imigração de células dos poços semeados (parte I) para os poços não semeadas parte (V) através dos modelos biogénicas induzidas por acção capilar. As células inicialmente semeadas atingido o fim da perna unseeded (Parte V) imediatamente depois saturação completa. Após 3 dias, a confluência das células foi evidente ao longo de todo o modelo. Após 7 dias, a formação da matriz de colagénio espaço-temporal ocorreu dentro das populações de células (H &amp; E de manchas). (Dimensão Molde: 3 cm de altura x 4 cm de comprimento x 1 cm de largura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um processo genérico passo a passo para criar um modelo semelhante a um osso com microcanais projetados é apresentado. As altas capacidades de absorção e retenção do molde são demonstradas pela ação capilar por meio de microcanais.

Modelos distintivo ação capilar por micro-canais em Osso-como pode aumentar o recrutamento de células para a Restauração da Grande Bony Defeito

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um microambiente modelo ósseo com a capacidade de restaurar ossos ausentes ou danificados. Isso é realizado primeiramente moldando e modificando uma esponja de poliuretano para que se encaixe em uma área de defeito. O segundo passo consiste em revestir uniformemente a esponja de poliuretano com uma suspensão viscosa de hidroxiapatita e deixá-la secar.O passo final consiste em posicionar o revestimento de hidroxiapatita no centro de um forno de alta temperatura. Em última análise, um molde semelhante ao osso, com microcanais projetados, é fabricado com altas capacidades de absorção e retenção celular. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como técnicas de lixiviação com sal ou impressão 3D, é que a engenharia dos microcanais induz a ação capilar nos defeitos ósseos.Este método pode ajudar a enfrentar grandes desafios na área da medicina regenerativa, como a reconstrução de defeitos ósseos cranianos, maxilofaciais e segmentares. As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento de deformidades congênitas. Os modelos são totalmente personalizáveis em forma e tamanho, e a ação capilar promoverá a migração celular em longas distâncias.Embora este método forneça informações sobre a regeneração óssea, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de cultura, como a plataforma de cultura de câncer 3D. Comece cortando esponjas de poliuretano com 80 poros por polegada em formas de ponte com dimensões de 3,5 centímetros de altura por cinco centímetros de largura por 1,5 centímetros de profundidade. Em seguida, prepare 100 mililitros de uma solução de hidróxido de sódio 4%.Usando um béquer de 150 mililitros, mergulhe as esponjas na solução de hidróxido de sódio e esprema para remover o ar aprisionado até que as esponjas fiquem completamente encharcadas. Após saturação, coloque o béquer com as esponjas em um banho ultrassônico a 42 quilohertz por 15 a 20 minutos sem aquecimento.Quando terminar, enxágue as esponjas com água destilada por cinco a dez minutos; durante o enxágue, comprima as esponjas e permita que elas se expandam de cinco a sete vezes para remover qualquer resíduo de hidróxido de sódio no interior das esponjas. Remova qualquer excesso de água das esponjas com toalhas de papel e, em seguida, coloque-as em uma estufa a 60 a 80 graus Celsius para finalizar a secagem. Para começar a preparar a suspensão de hidroxiapatita, pese primeiro um béquer de 50 mililitros com uma barra magnética de agitação.Em seguida, adicione 20 mililitros de água destilada ao béquer. Aqueça a água em uma placa aquecedora regulada entre 120 e 140 graus Celsius e agite utilizando o agitador magnético. Quando a água começar a ferver, adicione 0,3 gramas de pó de álcool polivinílico à água destilada, sob agitação contínua entre 300 e 400 RPM.Agite até que o pó tenha se dissolvido completamente e a solução esteja límpida. Em seguida, desligue o aquecimento e adicione 0,1 gramas de pó de carboximetilcelulose de sódio com viscosidade ultra baixa, continuando a agitar entre 400 e 500 rpm até que a solução fique clara. Após a dissolução completa, resfrie a mistura até a temperatura ambiente.Em seguida, adicione 0,3 gramas de dispersante de poliacrilato de amônio sob agitação a 300-400 rpm. Agite até dissolução completa e então adicione 0,2 gramas de glicerina sob agitação a 300-400 rpm. Misture até que esteja completamente dissolvido.Em seguida, pese 10 gramas de pó de hidroxiapatita em tamanho nanométrico e adicione-o lentamente ao béquer sob agitação de 600 a 900 rpm. Continue agitando por cinco minutos. A seguir, coloque a mistura em um ultrassônico e sonique por cinco minutos para garantir a dispersão de qualquer aglomeração do pó de hidroxiapatita. Então, adicione cinco mililitros adicionais de água destilada à mistura sob agitação de 600 a 900 rpm e aqueça a 90 a 100 graus Celsius, mantendo a agitação da mistura com um agitador magnético a 600 a 800 rpm e a 90 a 100 graus Celsius.Para evaporar o teor de água, meça o peso total, incluindo o béquer e a mistura, de tempos em tempos, até se obter uma proporção de pó para líquido entre 1,75 e 1,80. Conforme descrito no protocolo textual complementar, deixe a suspensão esfriar até a temperatura ambiente antes de utilizá-la para o revestimento, aplicando os esponjas de poliuretano preparados com a suspensão de hidroxiapatita usando uma espátula de aço inoxidável até que a suspensão esteja distribuída homogeneamente por toda a esponja de poliuretano sobre uma placa de vidro. Em seguida, sopre levemente sobre as esponjas utilizando um compressor de ar para garantir interconectividade, uniformidade e poros abertos.Se uma camada homogênea não for obtida, os moldes revestidos com hidrogel irão colapsar durante o processo de ING e também podem trincar durante o manuseio devido às baixas restrições de sustentação. Além disso, um revestimento homogêneo é essencial para criar microcanais dentro do conjunto. Seque os moldes revestidos com HA por um mínimo de cinco horas a 20–25 graus Celsius com circulação suave de ar.Aumente esse tempo para modelos maiores. Após o processo de secagem, coloque os modelos revestidos com ácido hialurônico em um cadinho Illumina. Em seguida, coloque-os em um forno de alta temperatura e siga o perfil de oito etapas descrito no protocolo textual complementar.Adicione 10 mililitros de células pré-osteoblásticas MC3T3 a 1 milhão de células em um único poço de uma placa de seis poços. Em seguida, posicione verticalmente o molde em formato de ponte, com dimensões de três centímetros por quatro centímetros por um centímetro, dentro da placa de seis poços. Coloque uma perna do molde em um poço contendo a suspensão celular e a outra perna em um poço adjacente vazio.Deixe o molde absorver a suspensão celular por 10 minutos em uma cabine de segurança biológica. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio adicional ao poço que foi originalmente preenchido com a suspensão celular. Após mais cinco minutos, adicione cinco mililitros de meio ao outro poço que não foi originalmente preenchido com a suspensão celular.Em seguida, coloque a montagem em uma incubadora. Troque o meio a cada dois dias durante sete dias. Ao final do experimento, fixe as células e o andróide por 20 a 30 minutos mergulhando-os em um béquer cheio de etanol a 100%.Coloque a coloração com hematoxilina no suporte lavado por um a dois minutos. Em seguida, lave-o por um a dois minutos, mergulhando novamente o suporte em um béquer com água destilada duas vezes após a lavagem. Desidrate o suporte nas células imergindo o suporte em etanol 70% por um a dois minutos. Em seguida, transfira o suporte para etanol 95% por mais um a dois minutos adicionais.Por fim, coloque o andróide em etanol a 100% durante dois minutos. Em seguida, contraclare o conjunto com e, s e Y por um a dois minutos. Então, enxágue-o por um a dois minutos, mergulhando novamente o andróide em um béquer com água destilada duas vezes.Após a lavagem, desidrate a estrutura imersão em uma série de etanol em concentrações crescentes antes da inclusão em resina. Por fim, inclua a estrutura em uma resina acrílica para seccionamento e imageamento. O modelo de microambiente biogênico mostrado aqui em várias etapas de fabricação consiste em uma rede trabecular porosa totalmente interconectada, semelhante à do osso trabecular.Este molde possui diversos componentes estruturais, incluindo poros primários interconectados com diâmetro de 300 a 400 micrômetros, microcanais com diâmetro de 25 a 70 micrômetros e nanoporos com diâmetro de 100 a 400 nanômetros na superfície, os quais permitem a fixação celular. O molde de microambiente biogênico favorece a semeadura celular por meio da ação capilar em todas as regiões do andróide. Imediatamente após a saturação completa, a distribuição celular pode ser claramente visualizada após coloração com hematoxilina, eosina e corte do andróide.O número de células em cada região do molde foi quantificado e monitorado após três dias de cultivo. Após sete dias de cultivo, o molde ficou ocupado por células que se proliferavam rapidamente, cada travecula foi envolvida por matrizes extracelulares e incorporada com células. Uma vez padronizada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter a proporção correta entre pó e água e garantir um revestimento homogêneo seguindo este procedimento. Outros métodos, como o sistema dinâmico de oscilação ou o sistema de cultura rotativa, podem ser realizados para responder a questões adicionais envolvendo respostas celulares.

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Bioengineering

Bioengenharia

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