Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar Salmonella En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

El objetivo general del siguiente experimento es determinar el porcentaje de salmonela citosólica y vacuolar en macrófagos infectados derivados de la médula ósea. Esto se logra infectando macrófagos con cereza M que expresa salmonella Ty aerium. Como segundo paso, las células se tratan con el detergente tonina, que permea la membrana plasmática, pero no las membranas vacuolares.

A continuación, las células se tiñen con un anticuerpo antis salmonela acoplado al ofor fluor Zi.In el fin de marcar el suero citosólico de salmonela, los resultados muestran el porcentaje de bacterias citosólicas entre las bacterias totales en función de la clasificación celular activada por fluorescencia o hechos. Estos metales pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción de patógenos, como si un patógeno intracelular se replica en un AV o en el citosol Inocular la cepa bacteriana un día antes de la infección En tres mililitros de medio Luria britani suplementado con estreptomicina y ampicilina en un agitador a 37 grados centígrados durante la noche para tener en cuenta las condiciones individuales. Agregue cubreobjetos a los pocillos de una placa de 24 pocillos que se usará como control para colocar las células en busca de semillas de infección, macrófagos derivados de la médula ósea de tipo salvaje o BM dms a una densidad de 0,125 millones de células por pocillo en un mililitro de medio macrófago primario, luego incube las células durante la noche en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente. Determine la concentración de salmonela en el cultivo nocturno midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros o OD 600 del cultivo diluido contra solución salina tamponada con fosfato. Esto garantiza que el diámetro exterior 600 se mida en el rango lineal del espectrofotómetro.

Calcule la concentración de salmonela por mililitro y OD 600 de uno corresponde a 1 billón. Las bacterias diluyen las bacterias en el medio macrófago para alcanzar una concentración de salmonela de 1,25 millones de células por mililitro para infectar las células con salmonela. Retire el medio de los MDM B.

Agregue un mililitro de medio macrófago a los pocillos de control no infectados, B uno a B tres y C uno a C3. Luego agregue un mililitro de suspensión de salmonela a los pocillos, del uno al cinco para llegar a una multiplicidad de infección de 10 bacterias por célula. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 300 veces G y 37 grados Celsius para sincronizar la infección antes de transferir la placa para incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono una hora después de la infección. Retire la placa de la incubadora para agregar 0,1 mililitros de medio macrófago que contenga gentamicina para matar las bacterias extracelulares.

Agregue gentamicina a todos los pocillos, incluso a los controles no infectados para garantizar que todas las células se traten de la misma manera. Luego transfiera la placa a una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono a las dos horas después de la infección. Retire la placa de la incubadora y lave todos los pocillos dos veces con un mililitro de docos precalentados, medio águilas modificadas o DMEM.

Reemplace el DMEM con un medio macrófago precalentado que contenga gentamicina para evitar el crecimiento de cualquier bacteria extracelular restante antes de transferir la placa de regreso a la incubadora justo antes del punto de análisis deseado. Prepare soluciones frescas de tampón KHM, tampón KHM con toin digital y tampón KHM con saponina. Además de las soluciones de anticuerpos como se describe en el protocolo de texto para realizar la permeación celular, retire la placa de la incubadora y lave los pocillos tres veces con 0,5 mililitros de tampón KHM precalentado.

A continuación, retire el tampón KHM y añada 0,25 mililitros de tampón KHM simple a los pocillos A, cuatro, B, uno, uno, y C, un tampón, con excavación toin en los pozos, A uno a tres, B, tres, B dos y C, dos, y tampón khm con saponina a los pocillos A, cinco, B, tres y C3, incube durante exactamente un minuto a temperatura ambiente antes de lavar inmediatamente todos los pocillos tres veces con 0,5 mililitros de tampón PREWARM KHM. Por último, retire el tampón KHM y añada las soluciones de anticuerpos primarios a los pocillos adecuados antes de incubar la placa durante 15 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono después de la incubación. Lave las células una vez con un mililitro de PBS para las células infectadas en pocillos, de uno a cinco.

Prepárese para el análisis de fax lavando las celdas tres veces con PBS. A continuación, añada 0,5 mililitros de PBS helado que contenga 0,1%Triton. A continuación, transfiera la suspensión de células a un tubo de fax de cinco mililitros con una tapa de filtro de células para romper los agregados de células mientras mantiene las muestras en hielo.

Analice las muestras en una máquina de fax utilizando los controles totalmente permeables. Establezca la puerta para el total de bacterias en función de la dispersión frontal y lateral y la señal mCherry. A continuación, analice la señal de fitz en la población bacteriana total utilizando los controles de permanente completo y no permanente para configurar las puertas para las bacterias citosólicas y las bacterias vacuolares con el conjunto de puertas.

Analice las muestras y determine el porcentaje de bacterias citosólicas frente a vacuolares utilizando el software FlowJo. De acuerdo con el protocolo del fabricante para los controles de permeación no infectados en los pocillos B uno a B tres y C uno a C3, prepárese para la microscopía retirando el PBS y agregando 250 microlitros de aldehído paraforme al 4% en la incubación de PBS durante 10 minutos a 37 grados Celsius después de la incubación. Lave los pocillos dos veces con un mililitro de PBS y a 250 microlitros de glicina 0,1 molar en PBS durante 10 minutos para enfriar el fijador, luego lave los pocillos dos veces con un mililitro de PBS para realizar la tinción secundaria de anticuerpos.

Tiñir los controles de permeabilidad durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios apropiados acoplados a fluoro cuatro en PBS. Esto se complementa con un 0,1% de saponina y un 3% de BSA. Para permear completamente las celdas, lave los cubreobjetos tres veces con un mililitro de PBS y monte los cubreobjetos para su análisis en un medio de montaje con dappy.

Analice los cubreobjetos con los controles con un aumento de 40 x o 63 x utilizando un microscopio de fluorescencia confocal. Aquí se muestran hechos típicos. Los resultados positivos y negativos se utilizan para establecer las puertas para m cereza positiva, bacterias Fitz positivas, que son citosólicas, salmonela, y m cereza positiva FITSI negativa, que es salmonella valar.

A partir de estas puertas, se determina el porcentaje de bacterias citosólicas y vacuolares en las muestras experimentales. En este ejemplo, se compara el tipo salvaje de salmonella typhimurium positivo para marañas con un mutante de deleción de CA en macrófagos MI derivados de la médula ósea que se muestra aquí es kexina y PD una tinción que se obtiene en controles de permeación tratados con digit, toin o saponina, ya que la calnexina es una proteína de membrana ER, la tinción de calnexina se puede ver en todo el citosol y alrededor del núcleo en ambas células de perme digit toin y saponina. En los controles de digit toin perme no hay DP, una tinción es visible.

Mientras que la tinción se puede observar en células de sasin y perme. Aquí se muestra un resultado de tinción anti salmonela en células que han sido permeadas con tonina. Las bacterias totales están en rojo, mientras que las bacterias citosólicas están en verde.

La población E positiva es salmonella con acceso al citosol. Si bien la población fite negativa es una bacteria que reside en una salmonela intacta que contiene vacuola o SCV y, por lo tanto, estamos protegidos del etiquetado FSE de salmonela aquí, la salmonela de tipo salvaje se compara con una cepa mutante de deleción CFE. Dado que la CA es necesaria para que la salmonela mantenga la integridad del VCS, se debe tener un buen porcentaje de salmonela Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo determinar el porcentaje de bacterias vasculares y citosólicas.