Preparação de mitocondriais frações enriquecidas para Análise metabólica em Drosophila

O objetivo geral do experimento a seguir é obter frações mitocondriais enriquecidas que produzam metabólitos mitocondriais suficientes para estudos metabolômicos usando drosophila melanogaster. Isso é conseguido primeiro criando uma quantidade suficiente de moscas para gerar metabólitos suficientes para frações enriquecidas mitocondriais. Como segunda etapa, as moscas são homogeneizadas em um homogeneizador de Teflon de vidro, que quebra a membrana celular sem danificar a integridade mitocondrial.

Em seguida, os homogeneizados são submetidos à centrifugação diferencial para gerar amostras mitocondriais enriquecidas. Os resultados mostram que alterações metabólicas mitocondriais pronunciadas foram detectadas usando este protocolo, que não foram detectadas usando análise metabolômica de base integral em frações enriquecidas mitocondriais e extratos de animais inteiros. A principal vantagem deste procedimento em relação a uma análise metabolômica de mosca inteira é que o isolamento das mitocôndrias antes da análise metabolômica permite uma maior sensibilidade e detecção do deslocamento do metabólito mitocondrial.

Para iniciar o experimento, aqueça os ingredientes do alimento da mosca em uma chapa quente a 90 graus Celsius. Mexa a mistura regularmente até ficar homogênea e ligeiramente densa. Remova os alimentos da fonte de aquecimento e mexa ocasionalmente quando os alimentos esfriarem a 80 graus Celsius a 0,2% TE decept metil quatro hidroxibenzoato dissolvido em 95% de etanol em seguida, divida os alimentos em dois volumes iguais.

Certifique-se de que a temperatura dos alimentos tenha diminuído para 50 graus Celsius e misture 1,1 mililitro de rapamicina 50 milimolar dissolvida em etanol em um volume e 1,1 mililitro de etanol não tratado no segundo volume. Para coletar adultos, use um regulador de estágio único para fornecer dióxido de carbono puro de um tanque de alta pressão. Em um fluxo contínuo de cinco PS, evito a eletricidade estática usando um tubo de plástico para canalizar o dióxido de carbono em um frasco filtrante de 500 mililitros com tubulação para borbulhar o dióxido de carbono através da água.

Para fazer isso, use uma rolha de borracha com um orifício para selar o frasco. Conecte o tubo de plástico à abertura lateral do frasco a uma almofada de dióxido de carbono para controlar a densidade larval durante o desenvolvimento. Coloque 25 pares de pais em uma garrafa de cultura e deixe-os botar ovos por 48 horas.

Em seguida, remova os pais para regular a densidade do ovo e repita essas etapas usando a prole F1 emergente para atingir duas gerações desse controle de densidade. Após duas gerações em condições de densidade controlada, separe as moscas por sexo, colocando-as na almofada por não mais do que 10 a 15 minutos. Permita que as moscas se recuperem da anestesia por 24 horas antes de colocá-las em condições experimentais.

Designe 300 moscas por amostra para gerar metabólitos suficientes para frações enriquecidas com mitocôndria. Transfira 150 moscas para uma gaiola caseira de um litro. Em seguida, transfira as 150 moscas restantes para uma gaiola separada de um litro e não superpovoe as gaiolas com mais de 150 moscas.

Use seis amostras replicadas por condição experimental e coloque as gaiolas a 25 graus Celsius em um ciclo escuro claro de 12 horas para terminar a criação da drosófila. Forneça às moscas alimentos frescos a cada dois ou três dias em um frasco com cinco mililitros de alimentos para manter a qualidade dos alimentos por um total de 10 dias. Comece o isolamento despejando moscas de uma gaiola em um homogeneizador de Teflon de vidro cheio de um mililitro de tampão de isolamento resfriado.

Em seguida, coloque um pouco de argamassa no gelo para manter as mitocôndrias intactas e homogeneizar as moscas com 15 pinceladas. Tomando cuidado para não torcer o pilão, transfira o homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue o tubo a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para um tubo diferente e centrifugar o sobrenadante a 6 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para enriquecer as mitocôndrias.

Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante que contém a fracção citosólica. Reese dobra o pellet em 300 microlitros de tampão de lavagem pipetando para cima e para baixo. Repita suavemente as etapas anteriores para o segundo giroscópio da gaiola.

Em seguida, combine os pellets ressuspensos de ambas as gaiolas em um tubo de microcentrífuga criogênica e centrifugue os pellets combinados a 6.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e congelar rapidamente o sedimento em azoto líquido. Finalmente, armazene as frações enriquecidas mitocondriais a menos 80 graus Celsius.

Este western blot exibe um enriquecimento da proteína de transporte da membrana mitocondrial, que serve como um indicador da separação efetiva das mitocôndrias nas frações mitocondriais. A proteína Poin é indetectável em frações citosólicas, enquanto a proteína tubulina, Uma proteína de microtúbulo citosólico não é detectada na fração mitocondrial, demonstrando a contaminação mínima de proteínas citosólicas. As análises de componentes principais ou PCA foram geradas usando os valores gerados a partir da análise de espectrometria de massa que foram normalizados para o log de concentração de proteína de Bradford transformado e amputado com valores mínimos observados para cada composto.

Os gráficos de PCA foram gerados usando metabólito completo. Perfis de cepas nativas e interrompidas de moscas trazem diferentes metabólitos de DNA mitocondrial obtidos com um extrato de mosca inteira padrão podem ser comparados com um PC. Um gráfico de metabólitos em extratos enriquecidos com mitocôndrias os perfis de metabólitos totalmente separados ao longo do eixo dois do PC e refletem os principais efeitos do tratamento com rapamicina. Existem apenas diferenças sutis entre os genótipos alternativos de M-T-D-N-A.

Em contraste, os perfis de metabólitos de extratos enriquecidos mitocondriais mostram uma separação entre o genótipo de DNA M mt nativo em alimentos normais e as outras três amostras, o MTD NA nativo em rapamicina e o MTD NA alternativo em alimentos normais ou rapamicina. Isso implica que o efeito da alternativa MTD NA muda os perfis de metabólitos de maneira análoga aos efeitos do tratamento com rapamicina. Ao fazer este protocolo, é importante, é recomendável fazer todas as distrações no mesmo dia, para diminuir a variabilidade entre as replicações.

Recomendarei ter um plano preparado com antecedência e rotulagem dos frascos, e acompanhar os registros de espera entre as réplicas para melhorar a qualidade de nossa preparação de amostras.